Optimización de la transformación genética y regeneración de ciruelo europeo "D´Agen" mediante un enfoque basado en diseño y optimización de experimentos

Abstract

Un requisito clave para la obtención de líneas transformadas y/o editadas genéticamente es el desarrollo de un protocolo simple, eficiente y reproducible de regeneración de plantas completas. Sin embargo, las especies del género Prunus se caracterizan por ser recalcitrantes al cultivo in vitro. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo eficiente para la regeneración in vitro y transformación para el ciruelo europeo 'D’Agen'. A través de una estrategia de Diseño y Optimización de Experimentos (DOE), se estudió el efecto de reguladores de crecimiento sobre variables respuestas de cada etapa del cultivo in vitro, con el fin de maximizar la eficiencia total del proceso. Los explantos iniciales fueron cotiledones de semillas obtenidas de la colección de germoplasma de la EEA San Pedro (INTA). Los tratamientos quedaron definidos para cada etapa en función del tipo de diseño (factorial o central compuesto) y del tipo, concentración y combinación de reguladores de crecimiento: TDZ, 2,4-D e IBA en la regeneración de brotes, BAP e IBA para multiplicación y elongación y ANA, KIN e IBA en el enraizamiento. Para la optimización de la transformación de cotiledones se utilizó la cepa C58C1 de Agrobacterium provista con plásmido pCambia2301-GUS y se determinó mediante análisis histoquímico la expresión transciente del gen marcador de la β-glucuronidasa (GUS). Se evaluaron tres OD de infección, dos métodos de enfrentamiento (vacío y sonicación) y el efecto de la acetosiringona en co-cultivo. El protocolo desarrollado permitió obtener un porcentaje elevado de regeneración in vitro (30-40%), y se pudo determinar las mejores condiciones de transformación transciente. Según nuestro conocimiento, este trabajo constituye el primer reporte de regeneración in vitro eficiente del ciruelo 'D’Agen'. Asimismo, se probó la eficiencia del DOE para optimizar el cultivo in vitro, lo que abre la posibilidad de extrapolar la estrategia de regeneración a otras especies del género.