Desarrollo de marcadores funcionales y evaluación de la diversidad genética en Eucalyptus globulus con énfasis en genes potencialmente involucrados en características de calidad de la madera

Abstract

Eucalyptus globulus es la especie forestal con mejor aptitud papelera y para la obtención de bioenergía a partir de celulosa, mayormente plantada en regiones templadas del mundo. Los proyectos genómicos en Eucalyptus han incrementado el número de secuencias disponibles en los bancos de datos públicos. Los marcadores funcionales públicos, si bien son frecuentes en diferentes cultivos, son aún escasos en especies forestales. De allí la importancia de la búsqueda y validación de regiones SSRs en genes de interés, para ser utilizados en futuros proyectos de mejoramiento asistido por marcadores (marker assisted breeding). En este estudio, se identificaron secuencias no redundantes de ADN de Eucalyptus (genómicas y ESTs) depositadas en bancos de datos públicos para revelar secuencias microsatélites y predecir, in silico, su función putativa. Éstas fueron luego validadas en laboratorio para predecir su potencial uso en análisis de diversidad genética. A partir de 12.690 ESTs de Eucalyptus globulus publicados en NCBI se identificaron 4.924 secuencias no redundantes. De éstas, 952 unigenes (19,3%) contenían 1.140 regiones SSR. Luego del análisis bioinformático de estos EST-SSRs, se diseñaron 979 oligonucleótidos novedosos y se predijo su función putativa, incluyendo categorías Gene Ontology (GO) según su proceso biológico, función molecular y componente celular. Se identificaron así 29 SSRs en 24 genes candidatos (estructurales y reguladores) para calidad de madera. Los SSRs se encontraron en promotores, intrones y exones de genes candidatos (GC) de distintas rutas metabólicas (biosíntesis del fenilpropanoico, biosíntesis de celulosa, metabolismo de hemicelulosas, ruta metabólica del shikimato, metabolismo de la metionina y genes de tubulinas y el factor de transcripción LIM1). Un total de 85 SSRs (56 EST-SSRs y 29 SSRs incluídos en GC) hallados en este trabajo fueron analizados para su validación en 8 genotipos de E. globulus, resultando positivos un 65%. A partir de esta validación se obtuvieron 17 EST-SSRs y 12 GC-SSRs polimórficos. Con éstos se estimaron los valores de diversidad en una muestra de 60 individuos no emparentados de E. globulus representantes de seis razas que cubren el rango de distribución natural de la especie. Los valores de PIC, Ho y UHe variaron ampliamente entre aproximadamente 0,02 y 0,9, mientras que el número de alelos varió entre 2 y 16, con un promedio de 7,55. Al realizar el test de Equilibrio de Hardy Weinberg (EHW) para los 29 loci, se encontró que 14 de ellos mostraron un significante déficit de heterocigotas (P<0,01). Este desvío del EHW podría explicarse por la presencia de subestructura poblacional y a la presencia de alelos nulos que sesgó las estimaciones de las frecuencias alélicas. Se realizó el estudio de transferibilidad de 49 loci (37 EST-SSRs validados (polimórficos y monomórficos) y los 12 GC-SSRs polimórficos) a otras seis especies de Eucalyptus (E. camaldulensis, E. dunnii, E. grandis, E. saligna, E. tereticornis y E. viminalis). Se encontró que 33 marcadores amplificaron en las seis especies estudiadas y seis en al menos cinco, mostrando la alta transferiblidad de los mismos. Finalmente, el estudio del polimorfismo y transferibilidad de los marcadores funcionales, permitió la selección de un conjunto de 13 (7 EST-SSRs y 6 GC-SSRs) altamente informativos y transferibles a otras seis especies de Eucalyptus. El conjunto de marcadores desarrollados son altamente informativos tendrán un uso potencial en estudios de diversidad genética, taxonomía, mapeo de QTL y en facilitar, en un futuro, la selección asistida en el mejoramiento de Eucalyptus.

Eucalyptus globulus is the most planted hardwood species for pulpwood in temperate regions. Genomic researches in Eucalyptus have increased the information available in DNA sequence`s public databases. Functional genetic markers, while frequent in crop, are still scarce in forest species. Hence the detection and validation of SSRs in interesting genes to be used in future projects of marker-assisted breeding are needed. Here, Eucalyptus DNA sequences (genomics and ESTs) from public databases were screened to identify non redundant sequences, to discover microsatellite sequences and to in silico predict putative gene functions. These were also validated in wet lab to predict their potential for functional genetic diversity analysis. From 12,690 updated E. globulus EST database published in National Center for Biotechnology Information a total of 4,924 non-redundant sequences were identified. From these ones, 952 unigenes (19.3 %) contained 1,140 SSRs. A new set of 979 primers were designed for putative SSR-markers after bioinformatic analysis. The predicted functions of these EST-SSRs were adjudged, including biological process, molecular function and cellular component Gene Ontology (GO) categories. Twenty four structural and regulatory candidate genes for wood quality carrying 29 SSR were indentified. Microsatellite sequences were located in promoters, introns and exons from candidate genes (CG) from: phenylpropanoid biosynthesis, cellulose biosynthetic process, hemicellulose metabolism, shikimate pathway, methionine metabolism, tubulin genes and the transcriptor factor LIM1. Sixty five percent out of a total of 85 SSR (56 EST-SSRs and 29 SSR containg GC) detected in this work were validated for actual PCR amplification of tree DNA samples in eight genotypes of E. globulus. From this assessment a total of 17 polymorphic EST-SSRs and 12 polymorphic CG-SSRs markers were obtained. These ones were selected for further analyses, so as to accurately estimate genetic information content in a larger sample of 60 non related trees represented major geographical races of the species’ natural distribution. PIC, Ho and UHe values varied over a wide range from around 0.02 to 0.9, whereas the allele number ranged from 2 to 16, with and average of 7.55. Fourteen out of the 29 loci tested showed significant deviation from Hardy Weinberg Equilibrium (HWE) showing a significant deficit of heterozygotes (P <0.01). This deviation from HWE could be explained by the presence of substructure population and the presence of null alleles that biased estimates of allele frequencies. A set of 49 loci (37 validated EST-SSRs (polymorphic and monomorphic) and 12 polymorphic CG-SSRs) were also tested for cross-transferability to other six Eucalyptus species (E. grandis, E. saligna, E. dunnii, E. viminalis, E. camaldulensis, E. tereticornis). A total of 33 out of the 49 validated markers in E. globulus amplified in the six other species and six markers amplified in at least other five. Finally, the analyses of polymorphism and transferability of functional markers, enabled the selection of a set of 13 (7 EST-SSRs and 6 GC-SSRs) highly informative and transferable to other six species of Eucalyptus. The set of highly informative markers developed here will have potential use in studies of genetic diversity, taxonomy, gene mapping and will help the improvement of Eucalyptus trough the assisted selection.