Identificación de genes de resistencia a Leptosphaeria maculans en genotipos locales de Brassica napus mediante marcadores moleculares

Abstract

La colza constituye el tercer cultivo oleaginoso a nivel mundial y presenta una alta demanda por sus características industriales que lo hacen apto para consumo humano, así como también para la producción de biocombustibles. La principal enfermedad fúngica en colza es conocida como cancro del tallo, producida por Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. y de Not. [Anamorfo Phoma lingam (Tode ex Fr.) Desm], un ascomycete hemibiotrófico. La resistencia a la misma puede ser del tipo cualitativa, presente en el estadio de plántula, en la cual se establece una interacción específica entre el gen R de la planta y el correspondiente gen de avirulencia del patógeno, o puede ser resistencia cuantitativa, la cuál es efectiva en plantas adultas mediante la acción acumulativa de múltiples loci de resistencia y más duradera (Delourme et al., 2006a; Rimmer 2006; Hayward et al., 2012; Raman et al., 2012, Larkan et al., 2016a). Una de las estrategias para aumentar la durabilidad de la resistencia cualitativa es la piramidización de genes, método a través del cual se busca combinar múltiples genes de resistencia en un mismo genotipo, de manera tal que todos estos genes R necesitan ser superados para que se manifieste la susceptibilidad a la enfermedad. El objetivo del presente trabajo de tesis fue seleccionar líneas portadoras de diferentes genes de resistencia, alto rendimiento y contenido de aceite, y adecuado perfil de ácidos grasos, para ser utilizadas como progenitores en el desarrollo de nuevos genotipos resistentes a P. lingam. Para ello se determinó el grupo de patogenicidad del aislamiento de P. lingam utilizado y luego se identificaron dentro de las 469 líneas experimentales de colza del programa, aquellas resistentes al aislamiento mediante inoculaciones artificiales. Las 59 líneas resultantes, se caracterizaron fenotípicamente para rendimiento, porcentaje de aceite y contenido de ácidos grasos en las campañas 2014 y 2015. Además, se caracterizaron genotípicamente, mediante la aplicación de diferentes tipos de marcadores moleculares para identificar los loci de resistencia Rlm1, Rlm4, Rlm3, BLMR2, RpgDun y LepR3. Los resultados de los ANOVAs indicaron que las variables rendimiento, porcentaje de aceite y perfil de ácidos grasos tuvieron interacción significativa con el ambiente por lo que se analizaron estadísticamente por campaña. Para todos estos análisis resultaron diferencias estadísticamente significativas entre líneas. El rendimiento promedio obtenido en la campaña 2014 fue de 2686,49 ± 339,92 kg/ha y de 2783,56 ± 457,37 kg/ha para 2015. Se puede destacar que las siguientes líneas dieron altos rendimientos en ambas campañas: 77C, 4R, 62L, 74L y 15(2)L, entre otras. El porcentaje de aceite promedio fue 42,52 ± 0,05% para 2014 y 44,39 ± 0,05% para 2015. Las líneas 76C, 9C, 32(3)C, 34(3)C y 32C fueron las de mayor X porcentaje de aceite para 2014 y 6R, 19R, 18R, 1R, 8R y 9L para 2015. El perfil de ácidos grasos promedio para todos los genotipos en ambos años, fue semejante al encontrado en países de larga trayectoria de producción, como Canadá, y estuvieron dentro de los valores aceptables para el consumo humano. Mediante un análisis de componentes principales para las variables fenotípicas de cada campaña, se encontró que un 81% de la variación total fue explicado por las dos primeras CP para 2014 y un 72% para la campaña 2015. Además, en ambas campañas se repite el patrón de correlación negativa entre ácido oleico y el resto de los ácidos grasos insaturados evaluados y el porcentaje de aceite. Por otro lado, también coincide en ambas campañas, que la CP1 separa a las líneas por el contenido de ácido oleico, contra las demás variables y la CP2 las separa por el contenido de ácido linoleico y rendimiento. En la caracterización genotípica, de las 59 líneas evaluadas, 24 tuvieron un único alelo de resistencia, seis fueron positivas para el alelo Rpg3Dun, una para Rlm1, 11 para LepR3 y seis para Rlm4. Otras presentaron dos alelos de resistencia, tres tienen la combinación Rlm1 y LepR3, dos Rlm4 y Rpg3Dun, otras dos Rlm4 y LepR3 y siete presentaron los loci LepR3 y Rpg3Dun. Se encontraron líneas que fueron positivas para tres alelos de resistencia, seis para Rlm4, LepR3 y Rpg3Dun y 1 para Rlm1, LepR3 y Rpg3Dun.Con el fin de hacer una correcta selección de líneas que sean portadoras de diferentes genes de resistencia y que además tengan buen rendimiento, alto contenido de aceite y adecuado perfil de ácidos grasos, se analizaron los resultados obtenidos mediante Procrustes generalizado (APG). La variabilidad explicada a través de los dos primeros ejes de la descomposición de la matriz de consenso del análisis fue de 89%. Luego de analizar el ARM (árbol de recorrido mínimo) obtenido para la configuración del consenso, las líneas seleccionadas para dar inicio a un programa de apilamiento genético fueron 62L (LepR3, Rpg3Dun), 52L Rpg3Dun, LepR3, Rlm4), 61C y 71L (Rlm1 y LepR3) las cuales contienen los alelos mencionados y presentaron muy buenas características fenotípicas.

Rapeseed is the third oil crop worldwide and has a high demand for its industrial characteristics that make it suitable for human consumption and production of biofuels. Stem cancer caused by L. maculans Phoma lingam (Tode ex Fr.) Desmaz] and it is the disease that most affects the crop. In order to identify resistance genes, artificial inoculations were carry out with a local strain of P. lingam in 469 experimental lines of the INTA Paraná breeding program. Fifty-nine lines were resistant. Using specific molecular markers, a genetic characterization of the resistant lines was perform to identify resistant genes (Rlm1, Rlm3, LePr3, Rpg3Dun, BLMR2 and Rlm4). The lines were characterize for yield, percentage of oil and content of fatty acids over two seasons (2014 and 2015).A Generalized Procrustes Analysis was conduct to correlate all the traits evaluated and identify elite lines. The lines62L (LepR3, Rpg3Dun), 52L (Rpg3Dun, LepR3, Rlm4), 61C y 71L (Rlm1 and LepR3) were selected as candidates based on their performance and multiple resistant genes combination, to develop a genetic stacking breeding program of the crop