Determinación del umbral de detección de Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae) por PCR

Abstract

La cochinilla harinosa de los frutales Pseudococcus viburni (Signoret) es una plaga cuarentenaria, presente en el Alto Valle de Río Negro y Neuquén, Argentina. Su detección durante la fiscalización aduanera, aun en los estados inmaduros, provoca rechazos de la fruta fresca argentina con destino a los mercados internacionales. Las técnicas actuales de identificación de pseudocóccidos y otros cocoideos implican la realización de preparados microscópicos que requieren varios días. Por esto, la disminución de los tiempos de identificación es importante sobre todo en las tareas de fiscalización. En este trabajo, se determinó el umbral de detección específica de P. viburni mediante PCR, como así también, la implementación de un método rápido de extracción de ADN mediante DNAzol™. Insectos de diferentes estados de desarrollo (huevo, ninfas (tres estados ninfales) y adulto), conservados en etanol pro análisis a -20 ºC, provenientes de montes frutales del Alto Valle, Argentina, fueron procesados según el protocolo del fabricante y se logró obtener ADN de buena calidad y concentración. Una alícuota del mismo fue utilizado como templado para una reacción de PCR usando primers específicos para P. viburni, registrados en bibliografía y como control positivo ADN de P. viburni de colección entomológica. Los primers utilizados y sus secuencias son A4 (5’-cccgcggccgttctctcttt-3’) y A5 (5’-tatgttgtgcatagttgtgtgtgcgc-3’), diseñados por Beuning et al. (1999). La amplificación generó una banda de peso molecular esperado de 650 pb. en gel de agarosa al 1.5% en todos los estadios, se determinó como límite de detección el estado de huevo. Esta técnica constituye una detección específica de P. viburni en un lapso máximo de 48 h.

The obscure mealybug Pseudococcus viburni (Signoret) is a quarantine pest present in the Upper Valley of Río Negro and Neuquén, Argentina. The detection of any growth stage of the mealybug in quarantine inspections often results in rejections of fresh fruit in countries where the fruit is exported. In this study the detection threshold of P. viburni was determined by PCR technique. The DNA extraction kit, DNAzolTM, was used as a fast DNA extraction method. By using the above extraction kit, good DNA quality and concentration was obtained from specimens of P. viburni of different developmental stages (including eggs, nymphs and adults) which were preserved in pro-analysis ethanol at -20ºC following the manufacturer protocol. One aliquote of this DNA was used as a template in a PCR reaction using specific P. viburni primers recorded in the literature and DNA of P. viburni from an entomological collection was used as a control. In all stages the amplification generated an expected size band of 650 bp visualized in an agarose 1.5% gel. The detection threshold of P. viburni using our method was an egg. These results involve a specific detection technique for P. viburni and reliable species identification in a space of 48 h.