Efecto del método de colecta de semen y plasma seminal sobre la supervivencia posdescongelación de espermatozoides ovinos

Abstract

Los objetivos del presente trabajo fueron determinar las diferencias en los eyaculados obtenidos con electroeyaculador (EE) y vagina artificial (VA) y evaluar el efecto del agregado de plasma seminal (PS) obtenido con EE y con VA sobre las características posdescongelación de espermatozoides (ESPZ) ovinos obtenidos con ambos métodos. Se colectó semen de cinco carneros Corriedale por 12 semanas durante la estación reproductiva, 2 veces/semana, alternando los métodos de colecta. Sólo los eyaculados que cumplieron con los estándares prefijados (volumen: ≥0,5 ml; concentración: ≥6x108 ESPZ/ml y movilidad masal ≥4) fueron utilizados para formar un pool por método y sesión de colecta. Con los pooles generados en las primeras 6 semanas se obtuvo PS y se evaluó volumen, pH, osmolaridad, concentración de minerales (magnesio, calcio, sodio, potasio) y fructosa. En cuatro pooles se realizó determinación de proteínas totales y separación electroforética en geles de poliacrilamida. Con los eyaculados colectados con VA se realizó espermatocrito para conocer la relación PS/ESPZ (57% PS/43% ESPZ). Con los pooles de las últimas 6 semanas se obtuvo ESPZ y se realizaron evaluaciones de calidad espermática (viabilidad, movilidad total y progresiva, integridad y funcionalidad de la membrana plasmática, funcionalidad mitocondrial y estado de maduración de la cromatina nuclear). Posteriormente los pooles se dividieron en fracciones que determinaron seis tratamientos: T1=ESPZ colectados con VA+PS de VA; T2-ESPZ colectados con VA+PS de EE; T3-ESPZ colectados con VA+ solución de lavado; T4-ESPZ colectados con EE+PS de EE; T5-ESPZ colectados con EE+PS de VA; T6-ESPZ colectados con EE+ solución de lavado. En cada tratamiento se agregó el mismo volumen de PS. Luego de una breve incubación los eyaculados reconstituidos fueron sujetos a las evaluaciones ya mencionadas. Posteriormente los tratamientos fueron mezclados con el diluyente de congelación y envasados en pajuelas para ser conservados en nitrógeno líquido. Luego de la descongelación, a los tratamientos se les realizaron nuevamente las evaluaciones de calidad, además de la determinación del estado de capacitación y del potencial fecundante de los ESPZ. Los datos fueron analizados mediante el procedimiento PROC GLM (SAS, 2000). Los eyaculados individuales colectados con EE tuvieron mayor volumen, menor concentración y número total de ESPZ que los colectados con VA. Los parámetros seminales evaluados en los tratamientos, previo a su congelación, fueron similares en los pooles obtenidos con ambas metodologías, excepto en el porcentaje de ESPZ con mitocondrias funcionales y de ESPZ con MP íntegra que fueron mayores para las muestras obtenidas con EE. El PS colectado con VA presentó mayor volumen, pH y menor osmolaridad que el PS obtenido con EE. En cuanto a la concentración de proteínas totales ésta fue similar para ambos métodos, sin embargo, fue diferente la distribución de las mismas, mientras que las proteínas de mayor peso molecular (60 a 225 kDa) fue mayor en el PS colectado con VA, las proteínas de menor peso (12-52 kDa) fue mayor en el PS colectado con EE. En la evaluación de los tratamientos luego de su descongelación sólo se detectó efecto del agregado del PS en la determinación del porcentaje de ESPZ con MP funcional. Los tratamientos conformados por PS obtenido con VA presentaron los mayores valores; por otro lado se determinó un efecto del método de obtención de ESPZ en el resto de las variables. Los tratamientos conformados por ESPZ colectados con EE tuvieron los porcentajes más elevados de ESPZ con MP íntegra, ovocitos bovinos fecundados y los menores porcentajes de células reaccionadas, independientemente del sustrato en el cual se encontraron suspendidos. En conclusión, el EE permite obtener eyaculados frescos con un porcentaje de ESPZ viables y mitocondrias funcionales superior al obtenido con VA. Además los ESPZ colectados con EE presentan, luego de la descongelación, mejor calidad y mayor potencial de fecundación in vitro.

The objectives of this study were to determine the differences in ejaculates obtained with electroejaculation (EE) and artificial vagina (AV) and evaluate the effect of the addition of seminal plasma (SP) obtained with EE and VA on the characteristics of thawed ram spermatozoa (SZ) obtained with both methods. Semen was collected from five Corriedale rams for 12 weeks during the breeding season, 2 times per week, alternating the collection methods. Only ejaculates that met predetermined standards (volume≥0.5 ml, concentration≥6x108 SZ/ml and mass motility≥ 4) were used to form a pool by method and collection session. Semen samples of the first 6 weeks were pooled by method of collection, centrifuged and the supernatant recovered to obtain SP and evaluated on volume, pH, osmolarity, mineral concentration (magnesium, calcium, sodium, potassium) and fructose. In four pools were determinate the total protein content and made electrophoretic separation in polyacrylamide gels. With ejaculates collected with VA was performed spermatocrit to determine the relationship SP/SZ (57%SP/43%SZ). Semen samples of the last 6 weeks were pooled by method of collection and washed to obtain SZ and evaluate sperm quality parameters (viability, total and progressive motility, integrity and functionality of the plasma membrane, mitochondrial function and maturation of nuclear chromatin). Then the pools were divided into fractions determined the six treatments: 1- SZ AV+SP AV; 2- SZ AV+SP EE; 3- SZ AV+ washing solution, 4- SZ EE+SP EE; 5- SZ EE+SP AV 6- SZ EE+ washing solution. In each treatment was added the same volume of SP. After a brief incubation, the reconstituted ejaculates were subject to the assessments mentioned above. All treatments were packing in straws (50x106 SZ/straw) and frozen. Straws were thawed at 37°C and were again carried out quality assessments, in addition to determining the state of capacitation and fertilizing potential of SZ. Data were analyzed using PROC GLM (SAS, 2000). Individual ejaculates collected with EE had a higher volume, lower concentration and total number of SZ than ejaculates collected with VA. The sperm parameters evaluated in the treatment prior to freezing were similar in both pools, except the percentage of SZ with functional mitochondria and SZ with full PM were higher for samples with EE. The SP collected with VA had a higher volume, pH and lower osmolarity than the SP obtained with EE. As to the total protein concentration was similar for both these methods, however, was different distribution of the same, while the higher molecular weight proteins (60-225 kDa) was higher in the SP collected with VA, lower weight proteins (12-52 kDa) was higher in the SP collected with EE. In the evaluation of treatments after thawing, we only detected effect of SP addition in the percentage of SZ with functional PM. The treatments conformed by SP obtained with AV had the highest values. Furthermore, there was observed an effect of SZ obtaining method. Treatments conformed by SZ collected with EE had the highest percentages of PM integrity, bovine oocytes fertilized and the smaller percentage of reacted cells, regardless of the substrate on which were suspended. In conclusion, the EE allows obtaining fresh ejaculates with higher percentage of live SZ and functional mitochondria than ejaculates obtain with AV. Therefore, SZ collected with EE have, after thawing, better quality and higher fertilization in vitro ability.