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resumen

Abstract
Cryptosporidium sp. es un parásito, protozoo que infecta a una gran variedad de hospedadores vertebrados. Entre las más de 30 especies validadas en el género, la especie zoonótica Cryptosporidium parvum es la principal causante de la criptosporidiosis bovina y representa una de las mayores causas de diarrea neonatal bovina. La vía de transmisión es fecal-oral, siendo el ooquiste, eliminado con las heces, el elemento infectante. La extracción de ADN [ver mas...]
 
Cryptosporidium sp. is a parasitic protozoa that infects a wide range of vertebrates. Among the 30 valid species, the zoonotic species Cryptosporidium parvum is the etiological agent of bovine cryptosporidiosis, representing one of the most important causes of neonatal diarrhea of bovines. The transmission route is fecal-oral and the oocyst, excreted with the feces, is the infective stage. Extraction of genomic DNA from oocysts starting from feces is [ver mas...]
 
dc.contributor.authorToledo, Jonathan
dc.contributor.authorLombardelli, Joaquín Andrés
dc.contributor.authorGalarza, Roxana Ivon
dc.contributor.authorTiranti, Karina
dc.contributor.authorGarro, Carlos Javier
dc.contributor.authorFlorin-Christensen, Mónica
dc.contributor.authorSchnittger, Leonhard
dc.contributor.authorTomazic, Mariela Luján
dc.date.accessioned2020-01-16T16:46:51Z
dc.date.available2020-01-16T16:46:51Z
dc.date.issued2019-07
dc.identifier.issn2591-5444
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/20.500.12123/6692
dc.description.abstractCryptosporidium sp. es un parásito, protozoo que infecta a una gran variedad de hospedadores vertebrados. Entre las más de 30 especies validadas en el género, la especie zoonótica Cryptosporidium parvum es la principal causante de la criptosporidiosis bovina y representa una de las mayores causas de diarrea neonatal bovina. La vía de transmisión es fecal-oral, siendo el ooquiste, eliminado con las heces, el elemento infectante. La extracción de ADN genómico del parásito a partir de materia fecal es esencial para la determinación de la especie o de la subgenotipificación de Cryptosporidium spp. y uno de los desafíos actuales es mejorar la sensibilidad de los métodos moleculares de diagnóstico. En este trabajo evaluamos diferentes combinaciones de métodos de lisis de ooquistes y de extracción de ADN específico con el fin de aumentar la sensibilidad de su detección en aplicaciones downstream como por ejemplo la PCR diagnóstica, basada en la amplificación del gen ARN ribosomal 18S. Tanto la combinación de lisis alcalina y extracción con fenol-cloroformoalcohol isoamílico seguida de un kit comercial, como la aplicación directa del kit comercial -sin pasos previos- resultaron efectivas cuando utilizamos materia fecal como punto de partida. Posteriormente, comparamos la detección de ADN de Cryptosporidium spp. a partir de materia fecal versus ooquistes enriquecidos, resultando esta última más sensible ya que se incrementa el volumen de muestra procesable. Finalmente, a partir de ooquistes enriquecidos de Cryptosporidium spp. comparamos dos métodos para su ruptura y dos de extracción de ADN. Esto incluyó combinaciones de lisis alcalina vs. congelado-descongelado en nitrógeno líquido para la ruptura de ooquistes y la comparación de dos kits comerciales para la extracción de ADN. La combinación de dos pasos de lisis previos a la utilización del kit comercial no mejora la obtención de ADN específico. De esta manera el método más sensible y adecuado consiste en un paso de enriquecimiento de ooquistes y la aplicación directa del kit comercial. En conclusión, este protocolo optimizado logró mejorar la sensibilidad del diagnóstico molecular de Cryptosporidium sp. notablemente, lo cual posibilitará la detección del parásito en muestras con bajo número de ooquistes.es_AR
dc.description.abstractCryptosporidium sp. is a parasitic protozoa that infects a wide range of vertebrates. Among the 30 valid species, the zoonotic species Cryptosporidium parvum is the etiological agent of bovine cryptosporidiosis, representing one of the most important causes of neonatal diarrhea of bovines. The transmission route is fecal-oral and the oocyst, excreted with the feces, is the infective stage. Extraction of genomic DNA from oocysts starting from feces is essential for species determination and/or subgenotipification of Cryptosporidium spp. A current challenge is the improvement of the sensitivity of molecular diagnostic methods. In order to increase the quantity of isolated DNA and the sensitivity of its detection, we evaluated in this study the efficiency of different lysis and DNA extraction methods for posterior detection by diagnostic PCR, which is based on the amplification of the 18S rRNA gene. The combination of alkaline lysis and extraction by phenol-chloroform followed by the use of a commercial kit as well as the exclusive use of a commercial kit resulted effective when applied to fecal samples directly. On the other hand, the addition of a freeze-thaw step after alkaline lysis did not increase the efficiency of parasite DNA detection in this type of sample. Later, we compared the detection of DNA of Cryptosporidium spp. from oocyst-contaminated feces and partially purified oocyst suspensions, showing the latter higher sensitivity as the volume of processable sample is increased. Finally, two protocols for oocyst disruption and two for DNA isolation were compared from purified oocysts. These included combinations of alkaline lysis and freezethaw. The combination of two lysis methods did not improved the extraction of specific DNA. Thus, the most sensitive and adequate method consists of an oocyst enrichment step followed by the direct application of the commercial kit. In summary this optimized protocol significantly improved the sensitivity of C. parvum molecular diagnosis which could allow parasite detection in samples contaminated with low numbers of oocysts.eng
dc.formatapplication/pdfeng
dc.language.isospa
dc.publisherUniversidad de Morónes_AR
dc.relationinfo:eu-repograntAgreement/INTA/PNSA/1115053/AR./Biotecnologías reproductivas y desarrollo de metodologías de diagnóstico, control y prevención de las enfermedades infecciosas y parasitarias que afectan la concepción, gestación y período neonatal en especies de interés zootécnico.es_AR
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/restrictedAccesseng
dc.sourceRevista de investigaciones científicas de la Universidad de Morón 2 (4) : 17-28. (Julio 2019)es_AR
dc.subjectCryptosporidium Parvumes_AR
dc.subjectCalveseng
dc.subjectTerneroes_AR
dc.subjectADNes_AR
dc.subjectDiagnosiseng
dc.subjectDiagnósticoes_AR
dc.subjectDisease Controleng
dc.subjectControl de Enfermedadeses_AR
dc.subjectFaeceseng
dc.subjectHeceses_AR
dc.subjectMolecular Biologyeng
dc.subjectBiología Moleculares_AR
dc.subjectDNAeng
dc.titleComparación de métodos de extracción de ADN para mejorar el diagnóstico molecular de Cryptosporidium sp. en materia fecal de terneros = Comparison of DNA extraction methods to improve the molecular diagnosis of Cryptosporidium spp. from fecal samples of calveses_AR
dc.typeinfo:ar-repo/semantics/artículoes_AR
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/articleeng
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioneng
dc.description.origenInstituto de Patobiologíaes_AR
dc.description.filFil: Toledo, Jonathan. Universidad de Morón. Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales; Argentinaes_AR
dc.description.filFil: Lombardelli Joaquín Andrés. Universidad Nacional de Río Cuarto. Departamento de Patología Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentinaes_AR
dc.description.filFil: Galarza, Roxana Ivon. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Rafaela; Argentinaes_AR
dc.description.filFil: Tiranti, Karina. Universidad Nacional de Río Cuarto. Departamento de Patología Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentinaes_AR
dc.description.filFil: Garro, Carlos Javier. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Patobiología; Argentinaes_AR
dc.description.filFil: Florin-Christensen, Mónica. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Patobiología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Morón. Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales; Argentinaes_AR
dc.description.filFil: Schnittger, Leonhard. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Patobiología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Morón. Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales; Argentinaes_AR
dc.description.filFil: Tomazic, Mariela Luján. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Patobiología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentinaes_AR
dc.subtypecientifico


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