Aplicación de un método de extracción de ADN a partir de sangre canina sensible y de bajo costo para el diagnóstico molecular de Leishmania sp. = Application of a sensitive and low cost method for the extraction of DNA from canine blood to the molecular diagnosis of Leishmania sp.

Abstract

La leishmaniosis canina (LC) es una enfermedad causada por hemoparásitos del género Leishmania. Los parásitos se transmiten a través de vectores flebótomos a los seres humanos y a otros mamíferos, generando cuadros tegumentarios y viscerales. Varios estudios han demostrado la eficacia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico molecular de LC. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método de extracción de ADN de Leishmania sp. para su aplicación en el diagnóstico molecular de LC en muestras de sangre canina. Para ello, se comparó la eficiencia de la resina Chelex 100 con la de un kit comercial y con el método tradicional de fenol-cloroformo, para extraer ADN de una muestra de sangre de un perro infectado con L. infantum. En el caso de Chelex 100, se evaluaron diferentes protocolos y se eligió el más conveniente. Para analizar los resultados, se amplificó por PCR un segmento de nucleótidos específico para Leishmania sp. en diluciones seriadas del ADN obtenido, y se registró la máxima dilución para la que se obtuvo una banda de amplificación. Los tres métodos mostraron una sensibilidad similar, hallándose detección hasta una dilución de 3 x 10-4 de la muestra original. Cuando la muestra de ADN extraída por Chelex 100 fue congelada a -20 oC durante 30 y 60 días, se observó que no hubo diferencias en la sensibilidad de la detección luego de estos periodos de almacenamiento. Comparado con el kit comercial, el método de Chelex 100 es 10 veces más económico y el doble de rápido. Estos resultados nos permiten concluir que el método de Chelex 100 constituye una herramienta rápida, sencilla, sensible y económica para la extracción de ADN de Leishmania sp. Es importante destacar que la obtención de muestras de sangre para la detección de LC constituye una técnica menos invasiva que el muestreo de médula ósea utilizado rutinariamente para este fin. En conclusión, al facilitar significativamente el diagnóstico de LC, nuestro trabajo tiene el potencial de mejorar la vigilancia epidemiológica y el manejo de esta enfermedad.

Canine leishmaniasis (CL) is a disease caused by hemoparasites of the genus Leishmania. The parasites are transmitted through sand fly vectors to humans and other mammals, generating tegumentary and visceral clinical cases. Several studies have shown the efficacy of polymerase chain reaction (PCR) for the diagnosis of CL. The objective of this work was to develop a method for Leishmania sp. DNA extraction for its application to the molecular diagnosis of CL in canine blood samples. To this end, Chelex 100 resin efficiency was compared to that of a commercial kit and the traditional phenol-chloroform method in its ability to extract DNA from a blood sample of a L. infantum-infected dog. In the case of Chelex 100, different protocols were evaluated and the most convenient was chosen. To analyze the results, a Leishmania sp.-specific nucleotide segment was amplified by PCR in serial dilutions of the extracted DNA, and the maximal dilution that yielded an amplification band was registered. The three methods showed a similar sensitivity, with detection until a dilution of the original sample of 3 x 10-4. When the DNA sample extracted by Chelex 100 was frozen at -20oC for 30 and 60 days, no differences in the sensitivity of detection were observed after these storage periods. Compared to the commercial kit, Chelex 100 is 10 times cheaper and twice as fast. These results allow us to conclude that the Chelex 100 method is a rapid, simple, sensitive and economic tool for Leishmania sp. DNA extraction. Importantly, blood sample collection for the detection of CL is a lesser invasive technique than bone marrow sampling, which is routinely used to this end. In conclusion, by significantly facilitating its diagnosis, our work has the potential to improve CL surveillance of infection and disease management.