Mapeo por asociación en girasol: diversidad nucleotídica, desequilibrio de ligamiento e identificación de genes involucrados en la resistencia a la podredumbre húmeda del capítulo

Abstract

El mapeo por asociación es una herramienta poderosa que permite la identificación de loci cuya contribución explica parte de la variación fenotípica observada. En general, los marcadores utilizados en estos estudios son los Polimorfismos de Nucleótido Simple (SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms) y los indels (eventos de inserción, insertion/deletion). Los objetivos de este trabajo comprendieron el estudio de la diversidad nucleotídica y el alcance del desequilibrio de ligamiento (DL) en girasol cultivado, y el diseño de una estrategia de mapeo por asociación para la resistencia a la Podredumbre Húmeda del Capítulo (PHC), causada por Sclerotinia sclerotiorum. La frecuencia de SNPs (1/61) y la diversidad nucleotídica (θ=0,0067) se determinaron sobre un panel de 31 genes y 19 líneas endocriadas de girasol. La frecuencia de SNPs en conjunto con un alcance del DL hasta 100 kb (r2~0,1) permitieron diseñar un estudio de asociación a través de la estrategia de genotipificación de genes candidatos. Un total de 30 genes candidatos fueron seleccionados a partir de: (1) el análisis de los perfiles transcripcionales de un genotipo de Brassica napus resistente a S. sclerotiorum, (2) una colección de transcriptos de expresión diferencial de una línea de girasol moderadamente resistente desafiada con S. sclerotiorum y (3) genes descriptos en literatura como partícipes en los procesos de defensa frente a PHC. La elección, caracterización y genotipificación de genes candidatos implicó la generación de herramientas para la selección de los mismos y la optimización de técnicas de genotipificación de SNPs a gran escala. La detección de moléculas heterodúplex mediante: (1) corte con la enzima endonucleasa CEL1 (CEL1CH) y (2) cromatografía líquida de alto rendimiento en condiciones de desnaturalización parcial (dHPLC), demostraron ser técnicas robustas y versátiles para aumentar el número de loci e individuos a incluir en los estudios de mapeo por asociación. Un total de 16 genes se genotipificaron exitosamente en la población de mapeo por asociación constituida por 134 accesos del Banco Activo de Girasol de la Estación Experimental Agropecuaria (EEA) INTA Manfredi. El análisis estadístico de asociación incluyó el uso de modelos lineales mixtos que corrigieron los problemas de estructuración y las relaciones de parentesco entre los individuos de la población de mapeo. Un alelo del gen RhoBP_B exhibió una asociación estadísticamente significativa con una menor incidencia de PHC (pp<0,05). Los resultados obtenidos demuestran que es posible encontrar alelos útiles implicados en caracteres complejos a través de los estudios de mapeo por asociación en girasol.

Association mapping is a powerful tool to identify gene loci that may contribute to phenotypic variation. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) and insertions/deletions (indels) have become the markers of choice to conduct these studies. The aims of this thesis were to study nucleotide diversity and the extent of linkage disequilibrium (LD) in cultivated sunflower to conduct association mapping for the resistance to Sclerotinia Head Rot disease. SNP frequency and nucleotide diversity were assessed using a set of 31 genes and 19 sunflower inbred lines (1SNP/61 pb, θ=0.0067). The relatively high frequency of SNPs found here, along with the predicted extent of LD over distances of 100 kb (r2~0.1) allowed the development of an association mapping strategy through candidate gene approach. A total of 30 genes were selected based on: (1) a microarray analysis from Brassica napus genotypes resistant to S. sclerotiorum, (2) differentially expressed genes from cDNA libraries from sunflower infected tissues; (3) previous literature reports. Different methods of candidate gene selection and optimization of SNP genotyping technologies for scale-up throughput were explored. CEL1 cleavage of heteroduplex (CEL1CH) and denaturing high performance liquid chromatography (dHPLC) proved to be robust and versatile techniques to increase the amount of loci and individuals to be included in the association panel. Sixteen genes were successfully genotyped in the association population composed by 134 inbred lines from INTA Manfredi Sunflower Germplasm Bank. Mixed linear models accounting for population structure and kinship relatedness were used for the statistical analysis of associations. One candidate gene, RhoBP_B, had significant results from association analysis, indicating that it might affect the quantitave variation in sunflower resistance to Sclerotinia Head Rot disease. These results demonstrate the potential of candidate gene association mapping for complex trait dissection in sunflower.