Aislamiento y caracterización de regiones promotoras de girasol para dirigir la expresión tejido específica de genes foráneos a semilla

Abstract

Desde el inicio de la utilización de variedades transgénicas, la superficie agrobiotecnológica ha aumentado exponencialmente, con un incremento del orden de 80 veces en solo 14 años, y su uso se ha expandido a más de veinte especies vegetales. Las ventajas obtenidas con estos cultivos transgénicos de primera generación incluyen: mejor control de insectos y malezas, mayor productividad, y una reducción del uso de agroquímicos. Los avances de la biotecnología en los últimos años permitirán, probablemente en un futuro muy cercano, el desarrollo de cultivos con características de interés para los consumidores, relacionadas con una mejora en la calidad nutritiva.. En este sentido las semillas constituyen un blanco ideal para este tipo de cultivos debido a sus propiedades de dormición, almacenamiento de nutrientes y la capacidad de germinar en condiciones limitantes de nutrientes. En este trabajo, se aislaron las regiones promotoras de tres genes específicos de semillas de girasol (Helianthus annuus L. HA89), que codifican para una proteína de transferencia de lípidos (HaAP10), una oleato desaturasa (HaFAD2-1) y una oleosina (HaOLE), las cuales fueron clonadas y caracterizadas “in silico”. Los fragmentos aislados de 964, 867 y 1838pb respectivamente, contienen en sus secuencias varios motivos específicos de semilla como elementos GCN4, motivos (AACA) y (ACTG), Prolamine-Box, E-Box, G-Box, sitos de unión SEF, Sh1 Box y elementos RY/G repetidos entre otros. A su vez, contienen motivos de respuesta a hormonas ABRE y GARE (ácido abscísico y giberélico) relacionados con desarrollo embrionario. Se realizaron análisis funcionales mediante la fusión de los promotores aislados al gen reportero GUS en plantas transgénicas de Arabidopsis y lechuga. No se observó actividad de la proteína reportera en ningún tejido vegetativo exceptuando los cotiledones de plántulas pequeñas. Al ser analizados a lo largo del desarrollo de la semilla, se observó tinción específica restringida a tejido embrionario. En los ensayos fluorométricos cuantitativos se observó actividad en estadios tardíos del desarrollo, similares a los patrones típicos de genes de reserva, siendo el HaFAD2-1 un promotor con una fuerte actividad especifica de semilla, con niveles similares a los del promotor constitutivo 35S. En este trabajo de tesis se confirmó que las regiones promotoras aisladas dirigen la expresión a semilla en forma específica y fuerte, con diferencias temporales, constituyendo, por lo tanto, importantes herramientas que podrán ser de utilidad en futuras aplicaciones biotecnológicas.

The successful engineering of genetically modified (GM) crops has been increasing exponentially, and its use has been widely extended in more than 20 species. The advantages obtained with this first generation of transgenics include: herbicide and pathogen tolerance, increased productivity and reduction of agrochemical use. Second generation crops will soon bring to the consumers products with better nutritious properties. In this regard, seeds are natural storage organs that accumulate high levels of lipids and proteins and constitute ideal targets for expression of recombinant proteins to increase nutritional contents and to develop molecular farming strategies. Here, we report the isolation and functional characterization of three novel sunflower seed-specific promoters which enconded for a sunflower lipid transfer protein HaAP10, an oleate desaturase HaFAD2-1 and an oleosin HaOLE. The 5’ fragments of 964 bp, 867 bp and 1838 bp respectively, were isolated, cloned and sequenced. Bioinformatic analyses of these sequences allowed the identification of several cis-elements involved in seed-specific transacting factors such as GCN4 motif, AACA motif, ACGT element E-Boxes, SEF binding sites and Sh1 Box. Among them, it is worth mentioning that ABRE and GARE elements which are related to embryo or seed development, were also identified. Putative promoter regions of these three genes were cloned into expression vector, directing the expression of the GUS gene. Arabidopsis thaliana and Letucce plants were transformed with these constructions. No GUS activity was displayed in any vegetative tissue. Although, promoter activity at different seed developmental stages showed GUS expression in embryos and mature seeds. Quantitative fluorometric assays showed activity on late seed developmental stage, similar to seed storage protein patterns, being the HaFAD2-1 a strong specific seed promoter with similar expression level to the 35S constitutive promoter. In this thesis we confirmed that the isolated regions are strong specific seed promoters, with distinct temporal expression patterns. These promoters represent potencial biotechnological tools that may be useful for future biotechnological applications.