Epidemiología molecular y genómica comparativa de Leptospira spp. en Argentina

Abstract

La leptospirosis es una enfermedad infecciosa causada por bacterias del género Leptospira y constituye una zoonosis de amplia distribución mundial. La enfermedad puede ser contraída a través del contacto con ambientes contaminados con orina de animales infectados, donde la principal vía de transmisión es el agua. Los brotes de leptospirosis en Argentina están asociados a cambios climáticos y en particular a inundaciones. A pesar de ello, en nuestro país existe escasa información de la situación epidemiológica actual de la enfermedad, principalmente debido a la subnotificación de casos y a su persistencia de tipo endémico en los animales. En los últimos años se han reforzado los análisis tendientes al conocimiento epidemiológico de esta enfermedad. En el campo de la epidemiología molecular, se desarrollaron distintos enfoques basados en PCR para la identificación y tipificación de aislamientos de Leptospira, siendo las más utilizadas: MLVA (análisis de VNTRs en múltiples loci) y MLST (tipificación por secuenciación de múltiples loci). Ambas tecnologías se basan en la amplificación por PCR, con la diferencia de que en el primer caso se trata de elementos de tipo minisatélite (unidades repetitivas en un rango de 8 a 100 pares de bases) y en el segundo caso los blancos de amplificación constituyen fragmentos de genes conservados o housekeeping que son secuenciados para su posterior análisis. Esta última se ha convertido en una técnica líder entre los métodos de tipificación molecular, debido a su alto poder discriminatorio entre distintos aislamientos bacterianos, su fácil aplicación y estandarización, además de la posibilidad de transmitir la información obtenida en distintos laboratorios a través de bases de datos públicas. Asimismo, las secuencias génicas obtenidas son aplicables a estudios poblacionales y epidemiológicos. En este trabajo se evaluaron y desarrollaron los principales métodos para la tipificación de Leptospira; la evaluación y aplicación de las técnicas MLVA y MLST permitieron identificar genotipos circulantes de manera mayoritaria entre aislamientos argentinos, tanto provenientes de animales de producción como en humanos. Se logró generar un nuevo esquema de MLST (7LA) para leptospiras patógenas a partir de la combinación de dos esquemas existentes, optimizando y unificando la metodología de tipificación. Las secuencias génicas generadas en este trabajo se encuentran publicadas en una base de datos disponible en internet (http://pubmlst.org/leptospira/), donde además de acceder a las mismas, puede aplicarse la metodología para la determinación de genotipos a partir de nuevos aislamientos, posibilitando la comparación de cepas a nivel mundial. El nuevo esquema se aplicó no solamente a los aislamientos argentinos, sino que se utilizó en la tipificación in silico a partir de 283 secuencias genómicas de aislamientos y cepas de referencias mundiales que fueron generadas en el marco de un proyecto de secuenciación genómica de este género. Se establecieron 199 genotipos diferentes donde el perfil de MLST denominado ST47 agrupó el 34 % de los aislamientos estudiados, similarmente a lo ocurrido para las muestras argentinas. Como consecuencia de los análisis filogenéticos y de formación de complejos clonales, se logró establecer una correlación entre genotipos y serogrupos al que pertenecen los aislamientos, aportando de esta manera una alternativa complementaria al diagnóstico serológico actual. En este sentido, se logró también la generación de un esquema de MLST reducido utilizando tan sólo tres de los siete marcadores del esquema 7LA. El esquema reducido (3LA) permitió la tipificación molecular directamente a partir de muestras clínicas, sin necesidad de contar con el aislamiento, que muchas veces es sumamente difícil de lograr debido a las características propias de esta bacteria. Este trabajo permitió entonces profundizar en el conocimiento de la variabilidad genética del género Leptospira y así generar información epidemiológica adecuada que pueda ser utilizada en programas de control y métodos de diagnóstico de esta enfermedad, constituyendo el primer trabajo en su tipo realizado en nuestro país.

Leptospirosis is an infectious disease caused by bacteria of the genus Leptospira, and constitutes a zoonosis of worldwide distribution. The water becomes the main route of transmission when it is contaminated by the urine of infected animals. The outbreaks of leptospirosis in Argentina are associated to climate changes and particularly to the occurrence of floods. However, there is little information on the current epidemiological situation of the disease in our country, mainly due to underreported cases and the persistence of endemicity in animals. Recently, epidemiological analyses have strengthened the understanding of this disease. In the field of molecular epidemiology, PCR-based approaches for the identification and typing of isolates of Leptospira have been developed. Currently, the most frequently used approaches are MLVA (Multiple Locus VNTRs Analysis) and MLST (Multilocus Sequence Typing). Both technologies are based on PCR amplification. However, for MLVA the amplification targets are minisatellite elements (repeats in a range of 8 to 100 base pairs), whereas MLST targets fragments of housekeeping genes that are sequenced for further analysis. MLST has become a leading technique among the molecular typing methods, because of its high discriminatory power between different bacterial isolates, easy application and standardization, plus the ability to share information obtained in different laboratories through public databases. Besides, the gene sequences generated by this method area applicable to population and epidemiological studies. In this work, we evaluated and developed the main methods for typing Leptospira. The implementation of MLVA and MLST techniques led to the identification of major genotypes circulating among Argentine isolates from both livestock and humans. A new MLST scheme (7LA) was generated for pathogenic leptospires by optimizing and unifying two pre-existing MLST strategies. The gene sequences generated through this work have been published in a database available online (http://pubmlst.org/leptospira/). The methodology can also be applied for the genotyping of new isolates, enabling the comparison of genotypes worldwide. In addition, the new scheme was applied not only to Argentine isolates, but was used in silico for the characterization of 283 genomic sequences of isolates and strains of global distribution, which were generated as part of a genome sequencing project dedicated to this genus. A total of 199 different genotypes were established, and the MLST allelic profile named ST47 grouped 34% of the studied isolates, in agreement with the previous studies on Argentine samples. As a result of the phylogenetic and clonal complexes analyses, we could establish a correlation between genotypes and serogroups, thus providing a complementary alternative to the current serological diagnosis. In this regard, the generation of a reduced MLST scheme was also achieved, by selecting only three of the seven markers from the 7LA scheme. The reduced MLST scheme (3LA) was applied to the molecular typing from clinical sample without the need of isolation, which is often difficult to achieve because of the particular characteristics of this bacterium. In summary, this work allowed us to deepen the understanding of the genetic variability of the genus Leptospira, thus contributing with suitable epidemiologic information useful to apply in the design of control strategies and also diagnostic methods for this illness. Thus, this study constitutes the first work of its kind conducted in our country.