Circulación y caracterización molecular de Rotavirus y Escherichia coli asociados a diarrea neonatal y septicemia en terneros

Abstract

Rotavirus, coronavirus y Escherichia coli son causas frecuentes de diarrea y septicemia en terneros neonatos y producen importantes pérdidas económicas. Si bien en Argentina hay estudios de ambos virus, es necesario disponer de información epidemiológica actualizada. Por otra parte, en nuestro país hay escasa información con respecto a los atributos de virulencia de E. coli asociada a diarrea y septicemia en terneros. Esta información es importante para el desarrollo de nuevas vacunas. En la presente tesis se evaluó la circulación de rotavirus y coronavirus en terneros de la provincia de Buenos Aires y se analizaron los genotipos de rotavirus y las relaciones filogenéticas entre las cepas. También se evaluó la patogenicidad de rotavirus G6(III)P[11] y G10P[11] en terneros. En una segunda etapa se caracterizaron los genes de virulencia (GV) de E. coli en muestras de terneros de establecimientos de la provincia de Buenos Aires. Además, se describió la patología asociada a la septicemia por E. coli en terneros y se la relacionó con los perfiles genéticos de virulencia. El estudio de rotavirus y coronavirus incluyó 32 establecimientos (18 tambos y 14 campos de cría) distribuidos en 16 partidos de la provincia. Se recolectaron 422 muestras de materia fecal en terneros de tambo (diarrea, 137; sin diarrea, 103) y de cría para carne (diarrea, 104; sin diarrea, 78). La detección de ambos virus se realizó por ELISA y las muestras positivas a rotavirus fueron genotipificadas (tipos G y P). En una selección de cepas (tambo, 12; cría, 11) se realizó el análisis filogenético de VP7 y VP8*. Las secuencias deducidas de aminoácidos de ambas proteínas fueron comparadas con respecto a las cepas vacunales. Para el estudio de E. coli se cultivaron 212 muestras de materia fecal. Las mismas se obtuvieron de terneros procedentes de 10 tambos (diarrea, 60; sin diarrea, 61) y 6 campos de cría (diarrea, 66; sin diarrea, 25), distribuidos en 9 partidos de la provincia. Las muestras de órganos y fluidos corporales (35) de terneros con septicemia (9) se analizaron por cultivo bacteriológico (26) e histopatología (22). Los aislamientos de E. coli (confluencia y colonias) se analizaron por PCR para detectar GV de E. coli enterotoxigénica (ETEC; sta, stb, eltA, f5 y f41), E. coli verotoxigénica- enterohemorrágica (VTEC-EHEC; vtx1, vtx2, eae y Ehly), E. coli enteropatogénica (EPEC; eae y bfp), E. coli necrotoxigénica (NTEC; cnf1 y cnf2) y E. coli septicémica (SePEC; f17G, papC, iucD, afa-8, clpG, cdtB y hlyA). En algunos aislamientos de E. coli asociados a septicemia y meningitis se evaluó la resistencia antimicrobiana. A partir del presente estudio se pudo demostrar que la circulación de rotavirus tuvo una amplia distribución en los tambos y campos de cría, mientras que la presencia de coronavirus quedó restringida a los establecimientos lecheros. La detección de rotavirus se asoció a la presencia de diarrea en ambos sistemas productivos y este virus es una causa importante de diarrea neonatal en nuestros rodeos. Las infecciones por rotavirus ocurrieron con mayor frecuencia en los terneros de cría y las infecciones por coronavirus fueron esporádicas. La frecuencia y diversidad de los genotipos G y P de rotavirus mostraron diferencias evidentes según el sistema productivo. En los terneros de cría existió un claro predominio de G6(IV)P[5], mientras que en los terneros

de tambo prevalecieron G6(III)P[11] y las infecciones mixtas (diferentes tipos G y P). Los análisis filogenéticos mostraron una correspondencia completa con los resultados de la genotipificación realizada por RT-PCR semi-anidada y múltiple, confirmando la utilidad de esta técnica con fines epidemiológicos. El análisis filogenético de VP7 indicó una íntima relación entre la primera cepa bovina G8P[11] de Argentina y diferentes cepas G8 de cabra y camélidos sudamericanos de nuestro país. Las cepas G6(IV)P[5] mostraron una estrecha relación filogenética de acuerdo a la ubicación geográfica de los establecimientos de cría para carne y, además, algunas cepas G6(IV)P[5] de tambo revelaron nuevas características filogenéticas. Las cepas circulantes G6(IV)P[5] y G10P[11] mantuvieron conservadas sus regiones antigénicas de VP7 y VP8* con respecto a las cepas vacunales. En cuanto a E. coli, el patotipo ETEC no sería una causa frecuente de diarrea en la región, aunque no se descarta su circulación. Los aislamientos de E. coli con GV característicos del patotipo SePEC (tipo-ExPEC) predominaron en las heces de terneros de cría y tambo. No se pudo establecer una relación entre la presencia de diarrea y la detección de GV o genotipos correspondientes a SePEC, NTEC y EPEC. Sin embargo, algunos aislamientos de E. coli obtenidos de materia fecal mostraron genotipos de virulencia idénticos a los observados en aislamientos de órganos y fluidos corporales de terneros con septicemia. Por lo tanto, una proporción importante de los terneros excreta cepas de E. coli potencialmente patógenas en sus heces, incluso en animales coinfectados con rotavirus y coronavirus. El marcador genético de virulencia f17G fue el más frecuente entre los aislamientos fecales de E. coli, independientemente de la condición clínica o el sistema productivo. Los aislamientos E. coli asociados a septicemia y meningitis presentaron perfiles genéticos de virulencia muy heterogéneos y el gen codificante para la aerobactina (iucD) fue el más importante.

Rotavirus, coronavirus and Escherichia coli are important etiologies of neonatal calf diarrhea and septicemia. Both diseases have a great economic impact on livestock industry. Although both viruses have been studied in Argentina, current epidemiologic information is further needed. On the other hand, knowledge regarding the virulence attributes of E. coli associated to diarrhea and septicemia is scarce in our country. This information is important for vaccine development. The circulation of rotavirus and coronavirus in calves from Buenos Aires province was evaluated in the current thesis. The genotypes and phylogenetic relatedness among the circulating strains were also assessed. Moreover, the pathogenicity of G6(III)P[11] and G10P[11] strains was studied in a dairy calf model. In a second stage, the virulence genes (VG) of E. coli isolates from calves reared in farms of Buenos Aires province were characterized. Furthermore, histological lesions in dairy calves with septicemic colibacillosis were described and their associations with the virulence gene profiles of E. coli isolates were investigated. The study of rotavirus and coronavirus was conducted in 32 farms (dairy, 18; beef, 14) situated in 16 counties from Buenos Aires province. Fecal samples (422) were collected from dairy (diarrheic, 137; non-diarrheic, 103) and beef (diarrheic, 104; non-diarrheic 78) calves. Rotavirus and coronavirus were detected by ELISA and positive samples were thereafter genotyped (G and P types). The genetic characterization of selected field strains (dairy, 12; beef, 11) was performed by nucleotide sequencing and phylogenetic analyses of VP7 and VP8*. Deduced amino acid sequences of both proteins were compared among circulating and vaccine strains. A comprehensive study for the VG of E. coli included 212 fecal samples from dairy (diarrheic, 60; non-diarrheic, 61) and beef (diarrheic, 66; non-diarrheic 25) calves, all of which belonged to 10 dairy and 6 beef farms distributed in 9 counties from Buenos Aires province. Several samples of organs and body fluids (35) were collected from septicemic calves (9) for standard bacteriological culture (26) and histopathology (22). Confluent bacterial growth and colonies of E. coli were analyzed by PCR to detect the virulence associated genes of enterotoxigenic E. coli (ETEC; sta, stb, eltA, f5 y f41), verotoxigenic-enterohemorrhagic E. coli (VTEC-EHEC; vtx1, vtx2, eae y Ehly), enteropathogenic E. coli (EPEC; eae y bfp), necrotoxigenic E. coli (NTEC; cnf1 y cnf2) and septicemic E. coli (SePEC; f17G, papC, iucD, afa-8, clpG, cdtB y hlyA). Sensitivity to different antimicrobials was evaluated in E. coli selected strains from septicemic calves. This study demonstrated that rotavirus circulation was widely distributed among dairy and beef farms, while the presence of coronavirus was restricted to dairy herds. The detection of rotavirus was associated to diarrhea in booth husbandry systems and this virus can be considered as an important etiology of neonatal calf diarrhea in our herds. Rotavirus infections were more frequent in beef calves while coronavirus infections were sporadic. The diversity and relative frequency of G and P genotypes were quite different according to the husbandry system. Most of the beef calves were infected with G6(IV)P[5] strains, while G6(III)P[11] and mixed infections (different G and P types) were prevalent in dairy calves. Phylogenetic analyses were in complete agreement with the genotyping results obtained by hemi-nested multiplex RT-PCR, confirming the usefulness of this technique for epidemiological purposes. The phylogenetic analysis of VP7 indicated a very close genetic relatedness between the first G8P[11] bovine strain from Argentina and other G8 strains recovered from goats and South American camelids in our country. The G6(IV)P[5] strains infecting beef calves exhibited a close genetic relatedness according to the geographic location of the farms, and some G6(IV)P[5] strains form dairy farms displayed novel phylogenetic characteristics. The antigenic regions of VP7 and VP8 * proteins from G6(IV)P[5] and G10P[11] strains were conserved when compared to reference vaccine strains. According to the genotyping results obtained for E. coli, the ETEC pathoype was not a frequent cause of diarrhea in the region under study, although its circulation ca nnot be dismissed. E. coli isolates from fecal samples of beef and dairy calves mainly displayed VG profiles typically of the SePEC pathoype. No relationship could be established between the presence of diarrhea and the detection of VG or genotypes corresponding to SePEC, NTEC and EPEC pathotypes. Nevertheless, some E. coli isolates from fecal samples exhibited virulence genotypes identical to those observed in isolates recovered from organs and body fluids of septicemic calves. Therefore, an important proportion of the calves population shed potentially pathogenic E. coli strains in their feces, even in calves coinfected with rotavirus and coronavirus. Regardless of the clinical condition of the calves and the husbandry system, f17G could be considered as the main genetic virulence marker of fecal isolates. E. coli strains associated to septicemia and meningitis exhibited a great diversity in their virulence gene profiles and the aerobactin-coding gene (iucD) was the most important.