Identificación y caracterización bacteriológica y molecular de cepas de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en productos lácteos y agua.

Abstract

La paratuberculosis (PTBC) o enfermedad de Johne es una enteritis crónica producida por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) que afecta a bovinos y otras especies. MAP ha sido vinculado en humanos a una inflamación crónica del intestino, denominada enfermedad de Crohn. La leche y sus subproductos sería una de las posibles fuentes de infección y se ha sugerido que esta micobacteria podría resistir las condiciones de pasteurización. El objetivo del trabajo fue identificar MAP en alimentos lácteos crudos y/o procesados y en agua, mediante cultivo y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la caracterización de las diferentes cepas aisladas. Se evaluaron diferentes protocolos para identificar MAP en leche cruda y comercial a través de cultivo y PCR y se determinó el límite de detección de ambas técnicas. Para la identificación de MAP en leche cruda, el protocolo de descontaminación de la muestra con menor límite de detección fue el método que utiliza ácido oxálico al 5% (p/v). Para la identificación de esta micobacteria a través de PCR, la extracción de ADN fue más eficiente utilizando el kit comercial evaluado y las perlas inmunomagnéticas. Se evaluó la supervivencia de MAP, E. coli, and S. Enteritidis durante la elaboración y almacenamiento tradicional de yogur. MAP no fue detectado durante la preparación del yogur, pero fue recuperado a los 180 min luego de la inoculación y durante el almacenamiento. Los recuentos de E. coli y S. Enteritidis aumentaron durante las primeras 24 hs, seguido de un ligero descenso hacia el final del estudio. Estos resultados demostrarían que MAP, E. coli, y S. Enteritidis resistirían las condiciones ácidas generadas durante la preparación de yogur y las bajas temperaturas del almacenamiento. También se evaluó la supervivencia de MAP en quesos blandos elaborados con leche bovina artificialmente inoculada con dos niveles diferentes de unidades formadoras de colonias (UFC) de MAP. Esta micobacteria no fue recuperada desde las muestras tomadas en las primeras etapas de la elaboración. Sin embargo, en los quesos elaborados con baja concentración de MAP, fue aislado hasta los 2 días de almacenamiento y en los inoculados con alta concertación de MAP, hasta los 15 días. Esto podría sugerir una adaptación de la bacteria al medio y posterior desarrollo. Se evaluaron 384 muestras de leche comercializadas en cuenca lechera Mar y Sierras de diferentes marcas comerciales, porcentaje de grasa y tratamientos térmicos. A cada una de las muestras se le realizó cultivo para identificación de MAP y otras micobacterias, recuento de bacterias aerobias mesófilas totales (BAMT) y el test de fosfatasa alcalina (FA) utilizando un kit v comercial. La totalidad de las muestras resultaron negativas al cultivo de micobacterias. Sin embargo, el 1,56% (6/384) de las muestras de leche comercial fueron positivas a PCR para identificación de MAP y el 40,1% (154/384) de las muestras resultaron positivas a la coloración Ziehl Neelsen realizada sobre el barrido de los cultivos negativos. Todas las muestras fueron negativas al test de FA y un 4,95% (19/384) de las muestras, el recuento de BAMT fue superior al límite que establece el Código Alimentario Argentino. Deberían ser evaluadas las medidas necesarias para evitar la transmisión de MAP y otras micobacterias dentro de establecimiento lecheros y enfatizarse las medidas de control en cuanto a higiene, cadena de frío, etc., tanto en industrias lácteas como en los puntos de venta para asegurar la calidad de los productos que llegan al consumidor.

Paratuberculosis (PTBC) or Johne´s disease is Chronic Enteritis disease caused by Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) which affects cattle and other animal species. MAP has been linked to Chronic Inflammatory Bowel disease in humans, named Crohn's disease. Milk and byproducts are possible sources of infection to humans as it was suggested that this mycobacterium could resist pasteurization conditions. The aim of this work was to isolate MAP in water and raw or processed dairy products by bacteriological culture and polymerase chain reaction (PCR) followed by molecular characterization of different strains isolated. In order to define the minimum concentration limit for detection of MAP in raw and commercial milk different culture and PCR protocols were evaluated. For the identification of MAP in raw milk, the decontamination protocol with lower detection limit was achieved by using oxalic acid 5% (w/v). DNA extraction methods were evaluated using the commercial kit and the immunomagnetic beads for PCR. During the traditional preparation and storage of yogurt, the survival of MAP, Escherichia coli, and Salmonella Enteritidis was evaluated. MAP was not detected during the preparation of yogurt, but was recovered 180 min after inoculation and during storage. The live bacterial counts of E. coli and S. Enteritidis increased during the first 24 hours of refrigerated storage, followed by a slight decrease at the end of the study. These results have demonstrated that MAP, E. coli and S. Enteritidis resist the acidic conditions generated during the preparation of yogurt and low temperature storage. MAP survival in cream cheese made from bovine milk artificially inoculated with two different concentrations of MAP was also evaluated. Viable MAP was not recovered from early stages of processing. However, during refrigerated storage, the cheese inoculated with a low concentration of MAP, the bacterium was isolated until the second day of storage while the cheese inoculated with a high concentration of MAP, and it was isolated until the 15th day of storage. These results suggest an initial adaptation of the bacteria to the environment with followed by a growth phase. Furthermore, 384 samples of commercial milk from Mar y Sierras area, representing different commercial brands, fat percentage and thermal treatments were evaluated. These samples were examined for MAP and other mycobacterium identification, count of total aerobic mesophilic bacteria (TAMB) count and alkaline phosphatase (AP) test using a commercial kit. All samples resulted negative to mycobacterium culture. Despite that, 1.56% (6/384) of the samples were positive to IS900 PCR and 40.1% (154/384) of the samples were positive for the vii Ziehl-Neelsen. All the samples were negatives to AP test and 4.95% (19/384) had TAMB counts higher than the limit established by the Argentine Food Code. In order to ensure the quality of dairy products to consumers, the necessary measures should be assessed to prevent the transmission of MAP and other mycobacteria in dairy establishment. Furthermore, an emphasize should be give to general measures of control such as hygiene, cold chain, etc. in dairy industries and retail stores.