Validación y verificación de qPCR con sonda Taqman basada en nrdB en la detección de Candidatus Liberibacter asiaticus = Validate and verify of nrdB-based Taqman probe qPCR in detection of Candidatus Liberibacter asiaticus

Abstract

El Huanglongbing de los cítricos (HLB) es una enfermedad causada principalmente por la bacte-ria Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) y representa una amenaza importante para la industria de los cítricos. En la actualidad, la detección se basa en observación de síntomas característicos y su confirmación mediante qPCR. Estos síntomas no siempre son fáciles de distinguir de los causados por otras enfermedades de los cítricos o factores abióticos, y se dificulta su diagnóstico fiable porque esta bacteria tiene una distribución y concentración desigual en la planta. Por ello, además de su detección mediante oligonucleótidos basados en la secuencia diana que se encuentra en el gen ARNr 16S, es ne-cesario confirmarla con otra qPCR que detecte en otro gen. Por ello se planteó validar y verificar meto-dología de detección con qPCR con sonda Taqman basada en el gen nrdB para detectar CLas en cítricos. Se realizaron qPCR con sonda Taqman a extracciones de ADN en 200 mg de peciolo y nervadura central mediante método de SDS y acetato de potasio, con lavado con alcohol. Se encontró que las condiciones de ensayo satisfacen criterios de aceptación de qPCR y que la detección del gen nrdB es de utilidad para verificar la detección de CLas.

Citrus Huanglongbing (HLB) is a disease caused primarily by the bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) and represents a significant threat to the citrus industry. Currently, detection is based on the visual observation of characteristic symptoms and their confirmation by qPCR. These symptoms are not easy to distinguish from those caused by other citrus diseases or abiotic factors, and reliable diagnosis is difficult because this bacterium has an uneven distribution and concentration in the plant. Therefore, the detection by oligonucleotides based on the target sequence found in the 16S rRNA gene requires to confirm its detection with another qPCR that detects another gene. Therefore, the aim was to validate and verify the qPCR detection methodology with a Taqman probe based on the nrdB gene to detect CLas in citrus. Taqman probe qPCRs were performed on DNA extractions from 200 mg of petiole and midrib using the SDS-potassium acetate method, with alcohol washing. The assay conditions were found to meet qPCR acceptance criteria, and detection of the nrdB gene was useful for verifying the detection of CLas.