Desarrollo de candidatos vacunales contra Babesia bovis basados en vectores virales y proteínas recombinantes

Abstract

La babesiosis bovina es una enfermedad parasitaria trasmitida por garrapatas y causada por los protozooarios intraeritrocíticos Babesia bovis y B. bigemina. Esta infección provoca importantes pérdidas económicas en varias regiones tropicales y subtropicales del mundo donde el vector está presente. En nuestro país, la zona ganadera afectada incluye el noreste y noroeste por encima del paralelo 33°S en donde la garrapata vector Rhipicephalus microplus encuentra las condiciones ecológicas adecuadas para su desarrollo. La vacunación contra la babesiosis bovina es una de las medidas de control existente para esta parasitosis y se realiza en terneros menores a los nueve meses de edad utilizando principalmente hemovacunas refrigeradas a base de cepas vivas atenuadas de estos parásitos. Si bien esta vacuna es efectiva en una única dosis, confiriendo protección durante toda la vida útil del bovino, presenta algunas desventajas en su producción, vida media y logística de distribución. Por este motivo, el desarrollo de alternativas vacunales que superen estas dificultades resulta de interés para mejorar las condiciones sanitarias de la región y aumentar la competitividad del sector. En este presente trabajo de tesis, se han desarrollado tres candidatos vacunales basados en las regiones inmunodominantes de tres antígenos de B. bovis altamente conservados e inmunodominantes para el bovino; estos son las proteínas MSA-2c (del inglés, Merozoite Surface protein – 2c), RAP-1 (Rhoptry Associated Protein – 1) y HSP20 (Heat Shock Protein 20). Estos 3 antígenos se han obtenido en dos plataformas de expresión diferentes: como vectores virales no replicativos y como proteínas recombinantes. El primer candidato es un virus vaccinia Ankara modificado (rMVA), un poxvirus no replicativo que codifica en un único marco de lectura estas tres regiones antigénicas como un multiantígeno al que denominamos rMABbo. Asimismo se ha desarrollado un Adenovirus recombinante (rAd) que codifica el mismo multiantígeno. También, se han obtenido en un sistema procariota las tres proteínas por separado y el multiantígeno recombinante como única poliproteína. Con los tres inmunógenos desarrollados, se estudió la respuesta inmune celular y humoral inducida por los mismos en el modelo murino en esquemas de vacunación “prime – boost” homólogos y heterólogos. Los resultados mostraron que la vacunación heteróloga que combinó el prime con rAd o con el rMABbo y el boost con el virus rMVA resultaron ser más efectivas que sus esquemas homólogos, pudiendo detectarse en ambos tipos de esquemas heterólogos altos títulos de anticuerpos específicos de tipo IgG con una mayor proporción del isotipo IgG2a, niveles significativos de IFN secretado y un alto porcentaje de células CD4+ y CD8+ productoras de una y ambas citoquinas de perfil Th1: IFNγ y TNFα Los aportes de este trabajo de tesis permitieron desarrollar nuevos inmunógenos recombinantes basados en un diseño racional de antígenos y plataformas de expresión para optimizar la respuesta inmune protectiva hacia Babesia bovis. Además se ha caracterizado la respuesta inmune inducida en el modelo murino, permitiendo dilucidar los aspectos claves a tener en cuenta para seleccionar la mejor estrategia vacunal a ser evaluada frente al desafío con Babesia bovis en bovinos, único modelo biológico para este parásito.

Bovine babesiosis is a tick – borne disease caused by the intraerythrocytic protozoan parasites Babesia bovis and B. bigemina. This infection causes economic losses in tropical and subtropical areas where the tick is present. In Argentina, the livestock area affected includes the northeast and northwest of the parallel 33° S, where the natural vector Rhipicephalus (Boophilus) microplus finds the ecological conditions for its development. To prevent babesiosis outbreaks in endemic areas, 4-9-month-old calves are vaccinated with live attenuated strains of both parasites. Even though these vaccines are effective in a single dose, conferring protection throughout the life of the bovine, they have some disadvantages in their production, half-life and distribution logistics. Hence, the development of alternative vaccines to overcome these difficulties is of great interest to improve sanitary conditions in order to increase the competitiveness of the livestock production. In this present work, three vaccine candidates have been developed. These immunogens are based on the immunodominant regions of three highly conserved B. bovis antigens that are also immunodominant for cattle: MSA-2c (Merozoite Surface protein - 2c), RAP-1 (Rhoptry Associated Protein - 1) and HSP20 (Heat Shock Protein 20). These three antigens were obtained on two different expression platforms: as non-replicative viral vectors and as recombinant proteins. The first candidate is a recombinant modified vaccinia Ankara vector (rMVA), a nonreplicative poxvirus which encodes an open reading frame of a multi-antigen (rMABbo) . This multi-antigen includes B and T cells epitopes of the three antigens mentioned above. In addition, a recombinant adenovirus (rAd) expressing the same rMABbo was developed. Besides, the complete rMABbo and each of the three antigens were expressed separately in E.coli and purified by affinity chromatography for delivery as subunit vaccines. The humoral and cellular immune responses induced by the three vaccine candidate were evaluated in both homologous and heterologous prime – boost immunizations. The results show that heterologous immunization combining the rAd or the rMABbo as a prime, with rMVA as a boost elicit the most effective immune response in terms of high specific IgG antibody titters with a major IgG2a subclass proportion (indicating a Th1 immune response), a significant level of secreted IFNγ and high percentages of both CD4+ and CD8+ T cells producing both IFNγ and TNFα cytokines. The present work contributes to the development of a new generation vaccine candidates based on a rational design and antigen expression platforms to optimize the protective immune response to Babesia bovis. The characterization of the immune response in the murine model is also an accessible approach to optimize the best vaccination strategy to be evaluated in cattle which is the only biological model against Babesia bovis infection.