Obtención de mutantes de Brucella abortus genéticamente definidas: su caracteización molecular y evaluación de su uso como vacunas para la brucelosis bovina

Abstract

El desarrollo de las técnicas de ADN recombinante permitió la generación de vacunas racionalmente diseñadas. Teniendo esto en cuenta, el objetivo de este trabajo es la obtención de cepas de Brucella abortus genéticamente modificadas que puedan ser utilizadas como vacunas contra la brucelosis. La brucelosis es una zoonosis bacteriana causada por especies del género Brucella, un grupo homogéneo de patógenos intracelulares facultativos que tienen la habilidad de sobrevivir y multiplicarse en fagocitos profesionales y no profesionales. En bovinos, Brucella abortus produce una enfermedad crónica caracterizada por aborto, nacimiento de terneros enfermos y fertilidad reducida. La cepa vacunal para la brucelosis bovina en uso en la mayoría de los países es la cepa B. abortus Sl9, que confiere un 70 a 80% de protección contra el aborto pero genera dificultades en el serodiagnóstico y conserva considerable virulencia residual para el hombre. Con el fin de obtener cepas de B. abortus que sean compatibles con un ensayo diagnóstico diferencial y que tengan menor virulencia residual que Sl9, se construyó la cepa doble mutante B. abortus INTA] (II) por inactivación de los genes bp26 y bmp18. BP26 es una proteína periplásmica inmunodominante durante la infección con Brucella que no influye en la persistencia ni en la protección de la cepa en ratones BALB/c. BMP18 es una lipoproteína de membrana externa, también descripta como Ompl9, cuya anulación en Sl9 genera menor capacidad de replicar en el bazo de los ratones aunque con igual persistencia y capacidad protectiva. La cepa INTAl resultó más atenuada que S19, pero mantuvo su capacidad protectiva en el modelo ratón. Esta cepa mostró mayor sensibilidad a temperatura, a agentes hidrofóbicos y a moléculas policatiónicas que Sl9 y esta sensibilidad fue revertida por una copia funcional del gen bmp18. Para determinar la contribución de BMP18 a la virulencia de Brucella, se generó la cepa Ml8v por inactivación de bmpl8 en la cepa patógena B. abortus 2308. M18v no mostró diferencias significativas respecto de S2308 en su habilidad para sobrevivir y replicarse en macrófagos, pero fue más atenuada en ratones. Por lo tanto, la falta de expresión de BMP18 generaría desorganización de la membrana externa, haciendo a la bacteria más susceptible a mecanismos bactericidas del suero pero sin afectar significativamente su supervivencia intracelular. Para evitar el uso de genes que confieren resistencia a antibióticos en el desarrollo de cepas vacunales, se diseñó una estrategia para la generación de mutantes ísogénicas utilizando el gen sacB como marcador de contraselección. Con esta estrategia, se obtuvo la cepa B. abortus Mlluc por reemplazo de parte de la secuencia de bp26 por el gen luc en Sl9 y posteriormente la cepa doble mutante INTA2 (I2) por deleción del gen bmp18 en la cepa M1luc. Al evaluar las cepas Mlluc e I2 en bovinos, la protección obtenida contra el aborto después del desafio con una cepa patógena fue equivalente para Sl9 y Mlluc pero menor para I2. Estos resultados indican que la falta de BP26 no tiene efecto alguno sobre la capacidad de Sl9 de inducir una respuesta inmune protectiva tanto en el modelo ratón como en el hospedador natural. Sin embargo, la falta de expresión de BMP18 en Sl9 genera menor capacidad protectiva en bovinos. En las condiciones de desafio experimental de este ensayo, la respuesta humoral contra BP26 cuantificada por iELISA presentó gran heterogeneidad y bajos niveles de sensibilidad, para parámetros de especificidad óptima. La estrategia desarrollada para la obtención de mutantes ísogénicas en más de un gen sin marcadores de resistencia a antibióticos permitirá la posibilidad de generar cepas de Brucella con múltiples mutaciones definidas de manera de obtener cepas vacunales efectivas y seguras para animales y humanos que puedan ser utilizadas en el control de esta enfermedad.

Recombinant DNA technology has led to the development of rationally designed vaccines. In this context, the aim of this project was to develop genetically modified strains of Brucella abortus that could be used as vaccines against brucellosis. Brucellosis is a bacterial zoonosis caused by species from the genera Brucella, an homogenous group of intracellular facultative pathogens that have the ability to survive and replicate in professional and non-professional phagocytes. In bovines, Brucella abortus produces a chronic disease characterized by abortion, birth of sick calves and reduced fertility. The vaccine strain in use for bovine brucellosis in most countries is B. abortus Sl9. This strain confers 70 to 80% protection against abortion but generates difficulties in serodiagnosis and retains considerable residual virulence for human beings. The double mutant strain B. abortus INTA1 (II) was constructed by inactivation of bp26 and bmp18 genes, with the objective of obtaining strains of B. abortus that could have an associated differential diagnostic test and that are less virulent than Sl9. BP26 is a periplasmic protein that is inmunodominant during infection with Brucella. The lack of expression of this protein in Sl9 does not affect the strain persistence or protection capacity in the mouse model. BMP18 is an outer membrane lipoprotein, also reported as Ompl9. When its expression was abrogated in Sl9, the resulting mutant strain showed less replication in mice spleen, suggesting attenuation, although it maintained its protection capacity. B. abortus I1 resulted more attenuated than Sl9 and retained its protection capacity in the mouse model. This strain showed more sensitivity than Sl9 to temperature, hydrophobic agents and policationic molecules, and this phenotype was reverted by a functional copy of bmp18. In order to establish BMP18 contribution to Brucella virulence, bmp18 gene was mutated in pathogenic strain B. abortus 2308, generating strain Ml8v. This strain did not show any significant differences respect to S2308 in its ability to survive and replicate in murine macrophages, but was more attenuated in mice. Therefore, lack of expression of BMP18 would disrupt membrane integrity, probably leading to more susceptibility to sera bactericidal mechanisms but not affecting significantly intracellular survival. In order to avoid the use of antibiotic resistance markets in the construction of vaccine strains, a mutagenesis strategy for obtaining isogenic strains using sacB as counterselection marker was developed. With this strategy strains B. abortus Mlluc (Sl9 ∆bp26::luc) and INTA2 (I2) (Sl9 ∆bp26::luc Abmpl8) were obtained, replacing most of bp26 coding region for luc gene in M1luc and then deleting also most of bmp18 in the double mutant 12, without incorporating drug resistance markers. When strains M1luc and 12 were evaluated in bovines, protection against abortion was equal for Sl9 and M1luc but considerably reduced for I2. These results indicate that lack of BP26 has no effect in Sl9 protection capacity either in mice or the natural host. However, lack of BMP18 in Sl9 generates less protection capacity in bovines. In the conditions of experimental challenge of this assay, the humoral response against BP26 recombinant protein measured by iELISA after challenge presented high heterogeneity and poor sensitivity respect to LPS response, considering parameters of optimal specificity. The strategy for generation of mutant isogenic strains in more than one gene without the incorporation of antibiotic resistance markers opens the possibility of achieving strains with multiple defined mutations. This will most certainly lead to effective and safer vaccine strains against brucelosis.