Procesamiento del material caseoso para determinar la presencia de C. Pseudotuberculosis en ovinos

Abstract

La Linfoadenitis Caseosa (LAC), es una enfermedad infectocontagiosa crónica causada por Corynebacterium pseudotuberculosis que se caracteriza por la formación de abscesos en ganglios y órganos. En la Patagonia, es común el hallazgo de ovinos y caprinos adultos enfermos, ocasionando una disminución en la producción y el decomiso de los órganos o canales afectados, originando pérdidas económicas en el sector pecuario. La infección en los ovinos produce un material caseoso característico purulento, de color blanco-crema o verdoso, consistencia viscosa y adherente, en algunos casos se observa material calcificado. Ante la sospecha de LAC, el diagnóstico de rutina es el cultivo bacteriológico del material con la identificación del agente causal, lo que supone un largo tiempo diagnóstico. Alternativamente podrían utilizarse métodos más rápidos, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA). Sin embargo, la consistencia adherente, pastosa o calcificada del material caseoso hace que su utilización para estos métodos sea poco reproducible y confiable. Con el fin de encontrar la mejor técnica para diagnosticar LAC, se está estudiando una PCR mejorada y se está poniendo a punto un ELISA directo para detectar C. pseudotuberculosis en material caseoso procesado, que luego serán correlacionadas. El objetivo de este trabajo fue evaluar si la aplicación de un tratamiento previo en muestras de material caseoso permite optimizar los resultados obtenidos con la técnica de PCR para la determinación de C. pseudotuberculosis. A futuro se pretende evaluar si las muestras procesadas de esta forma pueden ser utilizadas para la detección de C. pseudotuberculosis por ELISA. Se procesaron 58 muestras de órganos y ganglios de 46 ovinos con sospecha de LAC provenientes de la provincia de Santa Cruz. Cultivo bacteriano: se realizaron cortes de los abscesos y se tomaron muestras con un hisopo estéril para el aislamiento y la identificación de C. pseudotuberculosis. Tratamiento de la muestra: las muestras fueron procesadas de forma directa mezclando aproximadamente 50 mg de material caseoso con 150 µl de resina Chelex (Biorad, Argentina) o realizando un homogenato a partir de disgregar 50 mg de material con 200 µl de agua destilada estéril utilizando un pilón. Posteriormente 100 µl de homogenato fueron agregados a 150 µl de resina Chelex. Extracción de ADN: luego de incubar durante 20 min a 65 °C y posteriormente por 8 min a 100 °C, las muestras fueron centrifugadas (2 min, 10.000 g) y el sobrenadante recuperado. El ADN extraído se utilizó como templado en una reacción de PCR utilizando primers para el gen de la toxina fosfolipasa D producida por C. pseudotuberculosis, obteniéndose un producto de 203 pb. Los resultados de la PCR (muestra directa vs. homogenato) fueron analizados mediante el test χ2 (p<0.05), al igual que la comparación con los resultados obtenidos por cultivo. En el 100% de las muestras se aisló C pseudotuberculosis por cultivo, coincidiendo con los resultados obtenidos por la técnica de PCR con homogeneización previa. Sólo una muestra resultó negativa por PCR cuando no se realizó un homogenato. A su vez, la mitad de las muestras que fueron homogeneizadas previamente mostraron un incremento en la intensidad de la banda obtenida por PCR, mejorando su visualización. La concordancia entre los resultados obtenidos por cultivo y la PCR con el homogeneizado previo indica que este tratamiento debería tenerse en cuenta al procesar muestras con sospecha de LAC, ya que mejora la visualización de la banda amplificada por PCR, disminuyendo la repetición de muestras dudosas, reduciendo costos y demoras.