Producción del fitoestrógeno coumestrol en la alfalfa como respuesta a la infección por el complejo viral del achaparramiento

Abstract

Las plantas de alfalfa responden a diferentes factores de estrés estimulando la producción de dos tipos principales de compuestos: los coumestranos y los isoflavonoides. Los primeros presentan mayor importancia por su potencial actividad estrogénica en los animales que consumen alfalfa. Asimismo, los niveles de estos compuestos se pueden incrementar en los tejidos vegetales cuando se encuentran infectados por diferentes patógenos. El objetivo de esta tesis fue analizar la producción del fitoestrógeno coumestrol (COU) en plantas de alfalfa como respuesta a la infección del complejo viral del achaparramiento (CVA) y su relación con los síntomas provocados por el mismo. Para ello, se trabajó con clones de genotipos de los cultivares (cvs) de alfalfa: Monarca SP INTA (M10, M11, M18, M23, M29, M36 y M37) y Traful PV INTA (T112, T124, T129, T140, T141 y T152) y en dos condiciones de enfermedad: S: sano (sin infección viral) y E: enfermo (co-infección del alfalfa mosaic virus y alfalfa dwarf virus). El contenido de COU total (aglicona + COU conjugado) se extrajo en medio ácido y se determinó a través de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Además, se evaluó el efecto de la virosis sobre varias características morfológicas, fenológicas y productivas y sobre el índice de severidad por genotipo (ISG) en seis cortes realizados a los 380 grados-día de suma térmica. Se detectó COU constitutivo (basal) en la condición S en la mayoría de los genotipos de ambos cvs, con valores que fueron desde el límite de cuantificación (LC: 0,48 ppm) hasta los 1210 ppm. Según el contenido basal de COU, los genotipos se clasificaron en los siguientes niveles: no detectable (< 0,48 ppm), bajo (0,48-500 ppm), medio (501-950 ppm) y alto (≥ 951 ppm). La infección con el CVA se correlacionó directamente con el aumento en el contenido de COU en la mayoría de los genotipos, independientemente del cultivar al que pertenecieran, con incrementos del 14% al 28% en algunos casos. Esto constituye una información inédita para el cultivo de alfalfa en Argentina. A nivel de genotipos individuales de ambos cultivares, el CVA disminuyó el peso seco, la altura total de las plantas, el número de tallos y la distancia media de entrenudos; tendió a retrasar el desarrollo fenológico; y aumentó la relación hoja/tallo, sin que esto signifique necesariamente una mejora de la calidad forrajera. Los genotipos M10, M37 y T140 se mostraron más susceptibles al CVA, mientras que los genotipos T112, T124 y T129 mostraron una mayor tolerancia. Como ya se señaló, la virosis estimuló la producción de COU, aunque no todos los genotipos fueron capaces de incrementar significativamente su concentración. En algunos genotipos de Monarca, incrementos de COU mayores a 100 ppm se vieron acompañados por disminuciones en las estimaciones de ISG. También se observó que aquellos genotipos que mostraron valores de COU constitutivo de medio a alto exhibieron menores niveles de daño del CVA, lo que ratificaría el efecto “protector” de este fitoestrógeno frente a situaciones de estrés. La alta variabilidad entre los genotipos de alfalfa evaluados respecto de su producción de COU como reacción a la infección con el CVA, alienta las posibilidades de generar variedades resistentes al CVA y a otros factores de estrés a través de la selección y el entrecruzamiento de genotipos superiores.

Alfalfa plants respond to different stress factors by increasing the production of two main groups of compounds: coumestrans and isoflavonoids. The first ones are more important because of their potential estrogenic activity for the animals that consume stressed alfalfa plants, particularly the ones affected by different pathogens. The objective of this thesis was to analyze the production of coumestrol (COU) in alfalfa plants as a response to the infection with the dwarf/enation virus complex (CVA) and its relationship with the symptoms of the disease. Cloned genotypes of two alfalfa cultivars, Monarca SP INTA (genotypes M10, M11, M18, M23, M29, M36 y M37) and Traful PV INTA (genotypes T112, T124, T129, T140, T141 y T152), were assessed under two disease conditions: non-infected (S) and infected (E) with both alfalfa mosaic virus y alfalfa dwarf virus. Total COU content (aglycone + conjugated COU) was extracted in an acidic media and quantified by high resolution liquid chromatography (HPLC). On every clone, virus effect on several morphological traits, phenology, forage yield, and disease severity index (ISG) was estimated over six cuts. Cuts were performed every time plants reached 380ºC-day. Constitutive o basal COU (no infection) was determined in the vast majority of genotypes regardless cultivar of origin, with values that ranged from below the quantification level (0,48 ppm) to 1,210 ppm. According to their constitutive COU content, genotypes were classified as nondetectable (<0,48 ppm), low (0,48 to 500 ppm), medium (501-950 ppm) and high (≥ 951 ppm). CVA infection increased COU production in most of the clones of both cultivars, reaching increments of 14% to 28% in some cases. There is no record of this type of information in Argentina. In comparison to the same clones in the S condition, CVA not only decreased DM production (yield), plant height, number of stems and internode distance, but also delayed maturity (stage of development) and increased leaf/stem ratio. The latter does not necessarily mean an increase on forage quality. Genotypes M10, M37 and T140 were more susceptible to the virus complex, while genotypes T112, T124 and T129 were more tolerant. CVA stimulated COU production, even though not all the genotypes were able to do to a significant level. In some Monarca genotypes, increases of COU > 100 ppm were corresponded with decreases in the disease severity index. Genotypes with medium to high constitutive COU levels showed a trend to be less affected by the CVA, and thus supporting the putative “protective” effect to this phytoestrogen before stress situations. The high variability among genotypes for COU stimulation as a reaction to the virus complex, encourages the potential for developing CVA resistant varieties –and/or other stress factors- through selection and intercrossing of superior individuals.