Manipulación de la senescencia de alfalfa (Medicago sativa L.) por ingeniería genética

Abstract

En plantas forrajeras como la alfalfa, la senescencia foliar produce tanto una pérdida de la biomasa de forraje como una reducción de la calidad del mismo. Una estrategia molecular para retrasar la senescencia mediante la ingeniería genética se basa en la expresión de la secuencia codificante de la isopentenil transferasa (ipt), enzima clave en la biosíntesis de citoquininas. Para lograrlo resulta crítico la utilización de promotores con expresión no constitutiva que permitan la producción sitio-específica y autorregulada de citoquininas. La manipulación de la senescencia constituye un objetivo particularmente atractivo en especies forrajeras. Se transformaron clones de alfalfa con las construcción AtMYB32-ipt, se logró la regeneración de 3 plantas transgénicas, las cuales fueron confirmadas por PCR al amplificar el transgen ipt. La expresión del transgen se confirmó por RT-PCR y a través de la técnica de Southern blot se observó un patrón de inserción múltiple. También se estableció el patrón de expresión de la construcción AtMYB32-gus, la cual se limitó a los tejidos vasculares, con cierta variabilidad de expresión en la parte aérea las plantas. Los fenotipos observados en las plantas AtMYB32-ipt fueron desde plantas normales a plantas que perdieron la dominancia apical con raíces necrosadas en su mayoría. Se evaluó la senescencia foliar a través de bioensayos de hojas de plantas que incorporaron el transgen ipt y plantas que no lo incorporaron, se observó una senescencia foliar retrasada en plantas transgénicas, se cuantificó dicho retraso a través de los contenidos de clorofila a y b, proteínas foliares totales y cambios en el perfil de las proteínas foliares en geles SDS-PAGE (subunidad mayor de Rubisco). Se observó a los 35 días un mayor contenido de clorofila a y b, proteínas foliares y una mayor intensidad de las bandas de la subunidad mayor de Rubisco en las plantas que incorporaron el transgen ipt.

In forage crops like alfalfa, leaf senescence produces both a loss of forage biomass and a reduction in quality. A molecular strategy to slow senescence by genetic engineering is based on the expression of the coding sequence of the isopentenyl transferase (ipt), a key enzyme in the biosynthesis of cytokinins. The use of nonconstitutive expression promoters to allow site-specific and self-regulated production of cytokinins is critical to get this achievement. For these reasons, the manipulation of senescence is a particularly attractive target in forage species. Alfalfa clones were transformed with the construction of AtMYB32-ipt, 3 transgenic plants were regenerated, they were confirmed by PCR amplifying the ipt transgene. The transgene expression was confirmed by RT-PCR and a multiple insertion pattern was observed through the Southern blot technique. The expression pattern of AtMYB32-gus construction was also established, and it was limited to the vascular tissues, with some expression variability in the aerial part of plants. The phenotypes observed in AtMYB32-ipt plants were from normal plants to those that lost apical dominance and mostly with necrotic roots. Leaf senescence was evaluated through bioassays of leaves from plants that incorporated the ipt transgene and plants that did not not incorporated it, there was a observed a leaf senescence delay in transgenic plants, the delay was quantified through the contents of chlorophyll a and b, leaf protein totals and changes in leaf protein profile in SDS-PAGE (large subunit of Rubisco). A higher content of chlorophyll a and b and leaf protein were noted st 35 days and also an increased intensity of of the large subunit of Rubisco bands in plants that incorporated the ipt transgene.