Aplicación de técnicas no convencionales para la obtención de variabilidad genética en Panicum maximum Jacq.

Abstract

En los últimos años el incremento de la agricultura provocó un reordenamiento territorial de la ganadería hacia regiones extrapampeanas con ambientes más restrictivos. El “Gatton Panic” (Panicum maximum Jacq. cv. Gatton) fue introducido en la Argentina a fines de la década del 70 y, en la actualidad, es la forrajera megatérmica más difundida en el NOA. El cultivar posee un gran potencial de producción (6-9 Tn MS/ha), alto valor forrajero (60% Dig. MS, 12% PB) y es tolerante al pastoreo y a la sombra, por lo que se adapta bien a los sistemas silvopastoriles. Su principal limitante es la sensibilidad al estrés abiótico (bajas temperaturas, salinidad y sequía). Incrementar su tolerancia a tales condiciones aumentaría la superficie implantada y las opciones de siembra mejorando la oferta forrajera. Sin embargo, la falta o desconocimiento de la variabilidad en los materiales presentes en el país sumado a su complejo sistema reproductivo (apomixis) dificultan el mejoramiento. El desarrollo y la aplicación de técnicas biotecnológicas permitirá aumentar su variabilidad genética, hacer más eficientes los programas de mejoramiento y colaborar en el desarrollo de un mercado de cultivares de origen nacional que fortalecerá la sustentabilidad de la expansión ganadera en la región. En primer lugar, para esta tesis se dispuso de una muestra de semillas comerciales cuya calidad fue confirmada mediante citogenética (2n=32), test de viabilidad por tetrazolio (67,3%) y poder germinativo (29,7%). Tambien se estudiaron metodologías para quebrar la dormición y para la desinfección de las semillas. Luego, se sembró un stand de plantas en invernáculo y evaluó la capacidad de regeneración in vitro de diversos explantes del cultivar (semillas maduras, tallos e inflorescencias inmaduras) bajo distintas concentraciones y combinaciones hormonales. Así, se ajustó un protocolo de embriogénesis somática a partir de inflorescencias inmaduras (R0) sembradas en un medio MS con 5 mg/l 2,4 D y 0,15 mg/l BAP. De este modo, se obtuvo un 85,32% de inducción de callos y un 15,13% de callos embriogénicos, los cuales fueron repicados a un medio con 1 mg/l Kin y 1 mg/l Ga3, donde regeneró un 2% de plantas completas. Tambien se registraron problemas de oscurecimiento de callos y albinismo (10%). A los 50-65 días se obtuvieron 132 plantas entre las cuales se observó un individuo variegado que no transmitió su fenotipo a la progenie. El mismo protocolo también fue exitoso con el cultivar “Green Panic” (P. máximum var. trichoglume cv. Petrie) pero con menor eficiencia. Por otro lado, se estudió el tratamiento de semillas con dos agentes mutagénicos (EMS y rayos x) a diferentes concentraciones y condiciones de trabajo. Se calculó la DL50 y la eficiencia (estimada como la proporción de mutaciones clorofílicas en la M2 en relación a la frecuencia de efectos indeseables, como letalidad o nivel de daño de las plantas M1) de cada mutágeno. Se ajustó un protocolo de mutagénesis química sobre semillas secas tratadas con una solución de EMS al 3‰ durante 18 h (eficiencia=0,083). Del mismo modo, se ajustó un protocolo de mutagénesis con rayos x exponiendo semillas prehumedecidas en agua (16h) a 120 Gy (eficiencia=0,058). Ambos protocolos son complementarios. Tales herramientas servirán para generar variabilidad. Luego, en búsqueda de un método de selección se analizó la respuesta de la germinación del cultivar comercial ante condiciones artificiales de sequía y salinidad (concentraciones isosmóticas de manitol y NaCl). De este modo, se observó que la reducción del potencial afectó el porcentaje, la velocidad y el tiempo medio de germinación del cultivar. Asimismo, el tratamiento con NaCl generó un efecto detrimental aditivo debido a su componente iónico. Una concentración de 76 mM NaCl aprox. (ψo=-0,28 Mpa) redujo la germinación en un 50%. De la misma manera, se analizó el crecimiento de plántulas cultivadas en hidroponia bajo diferentes concentraciones de NaCl. Se reveló que a partir de los 100 mM NaCl (ψo=-0,36 MPa) en la solución de riego las plántulas evidenciaron signos notorios de estrés salino (fase iónica) (caída brusca en la tasa de expansión foliar en las hojas jóvenes y puntas senescidas en las hojas adultas) al sexto día de iniciado el tratamiento. En consecuencia, se redujo un 30,5% el área foliar acumulada, un 29,5% la altura y un 46,4% la biomasa seca acumulada a la finalización del ensayo. Tales concentraciones servirán como parámetro para la selección in vitro e in vivo de nuevos individuos tolerantes en sus diferentes etapas fenológicas. Por último, se realizó una transferencia exitosa de SSR diseñados en otras especies poáceas que permitió diferenciar al cultivar “Green Panic” del “Gatton Panic”. La adaptación de un mayor número de SSR podrá utilizarse como herramienta para la detección molecular de variabilidad genética.

In recent years the increase in agriculture caused a territorial reorganization of livestock towards "extra pampeanas" regions that have more restrictive environments. "Gatton Panic" (Panicum maximum Jacq. cv. Gatton) is the warm forage specie most cultivated in the NOA but it has growth limitations. Improve its abiotic stress tolerance (to drought and/or salinity, for example) could increase forage implanted area and meat production, enriching the national forage seed market. The absence or lack of variability in the genetic material of Argentina and its complex reproductive system (apomixis) promoted the application of non-conventional breeding tools. In this thesis two mutagenesis protocols were adjusted. Dry seeds were treated with 3 ‰ EMS solution for about 18 h (efficiency = 0.083), and moistened seeds (16 h on H2O) were exposed to 120 Gy x-rays (efficiency = 0.058). These dosis have showed higher efficiency according to germination rates and growth of seedlings. Both methods are complementary. Furthermore, a somatic embryogenesis protocol from immature inflorescences, which had not been reported in the literature, was developed. Regenerants from Gatton Panic and Green Panic were obtained. Cases of albinism and a variegated plant were reported but that phenotype was not transmitted to the offspring. Under artificial drought conditions (low osmotic potentials) the percentage, velocity and average time of germination were affected. An additive effect of salt treatments was observed due to ionic component. A concentration of 76 mM NaCl (7.6 dS/m) approx. (Ψo = -0.28 Mpa) reduced the germination by 50%. Likewise, the seedlings growing at 100 mM NaCl (ψo = -0.36 MPa) under hydroponic system began experimenting salt stress (phase change) at the sixst day after treatment starts, showing a 30.5% reduction in leaf area, 29.5% in height and 46.4% of dry biomass at the end of the trial. Such concentrations could be used for the selection of new tolerant individuals at different phenological stages under "in vitro" or "in vivo" systems. Finally, a successful transferability of SSRs designed from filogenetically related Grass species was achieved, allowing us to differentiate the Green Panic of Gatton Panic. The adaptation of more SSRs will allow it to be used as a tool for molecular detection of genetic variability.