Estudio de la variabilidad genética inducida por el genotipo mutador de cloroplastos de la cebada a través de la técnica de TILLING

Abstract

El aislamiento de mutantes inducidas en el plastoma a partir de tratamientos con mutágenos químicos y/o físicos es muy poco exitoso. El genotipo mutador de los cloroplastos de la cebada (cpm) es único en monocotiledóneas por inducir un amplio espectro de mutantes clorofílicas de herencia materna. Estas plantas mutantes se producirían por el mal funcionamiento de una proteína codificada por un gen nuclear desconocido involucrado en la reparación del plastoma. Hasta el momento, se pudieron identificar pocos cambios moleculares inducidos por cpm mediante el estudio de genes candidatos del plastoma. Así, se identificaron cambios puntuales como sustituciones e indels de una base en intrones y regiones codificantes de proteínas. Para lograr la dilucidación del sistema de reparación y/o del gen nuclear implicado en la inestabilidad genómica existente en cpm, se consideró necesaria la identificación de una mayor cantidad de cambios moleculares a nivel del plastoma en las plantas cpm. Se implementó una estrategia de genética reversa de búsqueda de mutantes y detección de cambios moleculares en el ADN conocida como TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes). Mediante la adaptación del TILLING al plastoma (cpTILLING), se analizaron 184 plántulas cpm pertenecientes a dos grupos con diferente número de generaciones de autofecundación y que presentaban deficiencias clorofílicas y/o cambios morfológicos. Se analizaron 33 genes y algunas regiones intergénicas. Se detectaron principalmente cambios puntuales: sustituciones (mayoritariamente transiciones) e indels de una o dos bases en microsatélites (repeticiones de mononucleótidos) y en menor medida indels de mayor tamaño (indels grandes) que tuvieron repeticiones directas en sus extremos. Estas repeticiones indicarían a la recombinación ilegítima como la causa de producción de los indels grandes. Por otro lado, la variabilidad detectada en uno de los genes analizados, el gen rpl23, sería mejor explicada por la existencia de recombinación ilegítima aumentada entre este gen y una versión no funcional del mismo, el pseudogen rpl23, que por la producción de mutaciones. La identificación de cambios puntuales, en especial la presencia de indels en microsatélites, y la identificación de eventos de recombinación ilegítima, conforman un escenario que es concordante con el espectro de cambios esperable por fallas en el sistema de reparación de mismatch repair direccionado al cloroplasto. El cpm se muestra como una buena herramienta para el estudio de la reparación del ADN del cloroplasto y para la generación de variabilidad en el plastoma de la cebada.

Isolation of plastome mutants induced by chemical and/or physical agents has not been successful. The barley chloroplast mutator genotype (cpm) is the only one in monocots inducing a wide spectrum of chlorophyll mutants with maternal heredity. These mutants would originate from the malfunction of a protein encoded by an unknown nuclear gene involved in chloroplast DNA repair. Until now, the identification of molecular changes induced by cpm has been done in a few cases by the postulation of plastid candidate genes. Substitutions and indels of one base were identified in protein coding gene regions and introns. With the aim of knowing the gene involved in the generation of cpm genome instability, the identification of more plastome molecular changes in cpm plants was considered necessary. The strategy chose for the detection of DNA molecular changes and mutants was TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes). TILLING adapted to the plastome (cpTILLING) was applied on 184 cpm seedlings with chlorophyll deficiencies and morphological changes coming from two groups with different number of selfpollination generations. Thirty three genes and some intergenic regions were analyzed. Substitutions (mostly transitions) and indels of one or two bases in microsatellites (mononucleotide repetitions) were mainly identified and to a lesser extent, cases of larger indels (big indels) carrying direct repeats were also identified. The presence of direct repeats would indicate illegitimate recombination as the cause of these big indels. On the other hand, the variability observed in one of the analyzed genes, the rpl23 gene, would be better explained by illegitimate recombination between this gene and its nonfunctional version, the rpl23 pseudogene, than by the occurrence of mutations. The identification of point mutations, especially indels in microsatellites, and the identification of illegitimate recombination events constitute a landscape that is coincident with the spectrum produced by the malfunction of the mismatch repair system targeted to the chloroplast. The cpm seems to be an interesting tool to study the chloroplast DNA repair and to generate variability in the barley plastome.