Rol de las toxinas binarias en las enfermedades intestinales causadas por clostridios enterotóxicos

Abstract

Las enfermedades digestivas causadas por especies del genero Clostridium poseen un importante impacto en la medicina tanto humana como veterinaria. Entre las especies patógenas más importantes de este género se encuentran C. perfringens y C. difficile. Ambos microorganismos pueden encontrarse presentes en el intestino de animales y seres humanos sanos y ante cambios en el ambiente intestinal, estas bacterias pueden proliferar y producir toxinas con efectos tóxicos a nivel intestinal y/o sistémico. El trabajo de esta tesis se realizó en base a la hipótesis general de que las cepas productoras de toxinas binarias de las especies Clostridium perfringens y Clostridium difficile representan un grupo de microorganismos patógenos intestinales altamente especializados capaces de afectar a bovinos de diferentes edades. En la primer etapa de este trabajo se realizó el aislamiento y caracterización de las cepas de C. perfringens y C. difficile presentes en rodeos bovinos de nuestro país. En este trabajo no se obtuvieron aislamientos de C. difficile y se obtuvieron aislamientos de C. perfringens de animales sanos y enfermos de diferentes edades, en proporciones similares. Durante el desarrollo de esta tesis, ocurrió un brote de enteritis hemorrágica en vacas de cría en el cual se aisló C. perfringens tipo E, productor de toxina iota (toxina binaria), siendo el primer caso descripto a nivel mundial que sucede en animales adultos. Por otro lado, este también es el primer reporte de enfermedad asociada a este toxinotipo en nuestro país. Las cepas de C. perfringens tipo E obtenidas fueron comparadas mediante MLST con cepas del mismo toxinotipo aisladas en América del Norte. Utilizando esta técnica fue posible determinar que los aislamientos tipo E analizados pertenecen a un mismo complejo clonal, independientemente de su origen geográfico. La presencia de este complejo clonal asociado a casos de enteritis hemorrágica en bovinos sugiere que este microorganismo se encuentra altamente adaptado y que la capacidad de producir enfermedad se debería a la acción combinada de factores de virulencia codificados en plásmidos y cromosoma. En base a este concepto se plantea que la virulencia de C. perfringens tipo E depende de la toxina iota junto con características complementarias propias de esta bacteria. Utilizando ratones como especie modelo, fue posible reproducir el efecto letal sistémico de la toxina iota únicamente a dosis relativamente altas de la misma. Este modelo, también permitió determinar un efecto enterotóxico de la toxina iota. En el desafío por vía intestinal, mediante inoculación intragástrica se observó una inhibición de la motilidad gastrointestinal, cambios en la homeostasis de líquidos y lesiones intestinales similares a las observadas en casos naturales de la enfermedad. Considerando la colonización intestinal por C. perfringens tipo E como el primer paso en la enfermedad producida por esta bacteria, y reconociendo que la enfermedad ocasionada por cepas del toxinotipo E pueda ser un evento accidental en el ciclo biológico de la bacteria, se realizaron estudios con el objetivo de definir un potencial rol biológico para la toxina iota, y su participación en la colonización del intestino de los mamíferos. Utilizando un modelo en células Caco-2 se observó que la toxina iota induce la formación de extensiones en la superficie de los enterocitos a las cuales se adhieren las células vegetativas de C. perfringens tipo E. De acuerdo a los resultados obtenidos comparando el efecto de la toxina iota sobre la adherencia de otras cepas de C. perfringens, es posible sugerir que estas extensiones son aprovechadas de manera diferencial por las bacterias pertenecientes al toxinotipo E. Además se propone que la inhibición intraespecífica es otro mecanismo involucrado en la colonización intestinal y posiblemente en la dominancia clonal observada en casos naturales de infección por C. perfringens tipo E. En los sobrenadantes de estas cepas se detectó un péptido con acción antimicrobiana, el cual demostró poseer un amplio espectro de inhibición contra diversas cepas de C. perfringens. In vitro fue posible observar que en cultivos conteniendo una mezcla de bacterias tipo A y tipo E, finalmente predominaban las células tipo E. Los resultados obtenidos in vivo fueron similares pero debido a la complejidad del medio intestinal no fue posible determinar el efecto individual de la toxina iota o el péptido antimicrobiano sobre la colonización. Estos resultados analizados en conjunto permiten, por primera vez, entender el desarrollo de la enfermedad asociada a C. perfringens tipo E en bovinos y proponer un modelo de infección de este toxinotipo, asociado a la producción de toxina iota y a la capacidad diferencial de adherencia al epitelio gastrointestinal, establecimiento y colonización por parte de la bacteria.

Digestive diseases caused by species of the genus Clostridium have a major impact on both human and veterinary medicine. Among the most important pathogenic species of this genus are C. perfringens and C. difficile. Both microorganisms may be present in the intestines of healthy animals and humans and due to changes in the intestinal environment, these bacteria can proliferate and produce toxins with intestinal and/or systemic toxic effects. The work of this thesis was performed based on the general hypothesis that the binary toxin -producing strains of the species Clostridium perfringens and Clostridium difficile represent a group of highly specialized intestinal pathogens capable of affecting cattle of different ages. In the first stage of this work, the isolation and characterization of strains of C. perfringens and C. difficile present in cattle herds in our country was performed. In this study no C. difficile isolates were obtained and C. perfringens isolates from healthy and sick animals of different ages were obtained in similar proportions. During the development of this thesis, an outbreak of hemorrhagic enteritis in breeding cattle from which C. perfringens type E, iota toxin (binary toxin) producer was isolated occurred, being the first worldwide case described in adult animals. On the other hand, this is also the first report of illness associated with this toxinotype in our country. Obtained C. perfringens type E strains were compared by MLST with strains of the same toxinotype isolated in North America. Using this technique it was possible to determine that type E isolates analyzed belong to the same clonal complex, regardless of their geographic origin. The presence of this clonal complex associated with cases of hemorrhagic enteritis in cattle suggests that this microorganism is highly adapted and the ability to produce disease is due to the combined action of virulence factors encoded in plasmids and chromosome. Based on this concept, it is propound that the virulence of C. perfringens type E depends on the iota toxin along with complementary characteristics typical of this bacterium. Using mice as a model species, it was possible to reproduce the systemic lethal effect of iota toxin only in relatively high toxin doses. This model also allowed to determine an enterotoxigenic effect of iota toxin. In the intestinal tract challenge by intragastric inoculation inhibition of gastrointestinal motility, changes in the homeostasis of fluids and intestinal lesions similar to those observed in natural cases of the disease were observed. Considering the intestinal colonization by C. perfringens type E as the first step in disease caused by this bacterium and recognizing that the disease caused by toxinotype E strains can be an accidental event in the life cycle of the bacteria, studies were conducted in order to define a potential biological role for the iota toxin and its participation in the colonization of the intestine of mammals. Using a model in Caco-2 cells was observed that iota toxin induces the formation of extensions on the surface of enterocytes in which vegetative cells of C. perfringens type E attach. According to obtained results comparing the effect of iota toxin on adherence of other strains of C. perfringens, it is possible to suggest that these extensions are differentially exploited by E toxinotype bacteria. In addition, it is proposed that intraspecific inhibition is another mechanism involved in intestinal colonization and possibly clonal dominance observed in natural cases of infection by C. perfringens type E. In supernatants of these strains a peptide with antimicrobial activity was detected, which have demonstrated a wide spectrum of inhibition against various strains of C. perfringens. In vitro was observed that in cultures containing a mixture of type A and type E bacteria eventually predominates cell type E. The results obtained in vivo were similar but due to the complexity of the intestinal environment was not possible to determine the individual effect of the iota toxin or antimicrobial peptide on colonization. These results analyzed together allow, for the first time, to understand the development of the disease associated with C. perfringens type E in cattle and propose a model of infection of this toxinotype associated with iota toxin production and the differential ability to adhere to gastrointestinal epithelium, establishment and colonization of the bacteria.