In vitro propagation of Lippia integrifolia (Griseb.) Hier. and detection of genetic instability through ISSR markers of in vitro-cultured plants.

Abstract

Aromatic and medicinal plants have been traditionally harvested from the wild and, in Argentina, they have been exploited without any major limitation. In vitro plant propagation is an easy and inexpensive method to obtain huge amounts of plants in a short period. This practice is relevant for the propagation of valuable and endangered species, facilitating their conservation and germplasm breeding. Since tissue culture can induce genetic and phenotypic variations, collectively termed “somaclonal variation”, molecular markers have been used to determine the genetic variability induced. In this work, successful propagation of Lippia integrifolia (Gr.) Hie (“incayuyo”) was achieved with 2,2 µM of bencylaminopurine added to the Murashige-Skoog medium. Shoots were recovered from the development of axillary meristems and through de novo shoots regeneration from organogenic calluses. Regenerated plants were taken to an experimental trial nearby their natural habitat for their evaluation in an agricultural environment. From the moment phenotypic variants started to appear in the ex vitro regenerated plants, the genetic variability of both kinds of recovered materials was studied by intersimple sequence repeats. Thirteen markers were used, detecting polymorphisms with all the primers tested in both types of recovered plants. The existence of polymorphisms implies that the genetic stability must be evaluated in all the ex vitro recovered plants. The protocol developed here is the first step to be applied in biotechnological techniques employed to improve the quality of “incayuyo”. Moreover, this is the first work employing molecular markers in L. integrifolia.

Las plantas aromático-medicinales han sido tradicionalmente recolectadas de su medio natural, y en Argentina, han sido explotadas sin ninguna limitación. La propagación in vitro de plantas es un método fácil y económico para obtener grandes cantidades de plantas a corto plazo. Esta práctica es relevante para la propagación de especies valiosas y en peligro de extinción, facilitando su conservación y mejoramiento. Debido a que el cultivo de tejidos puede inducir variaciones genéticas y fenotípicas, comúnmente denominadas "variación somaclonal", los marcadores moleculares se han utilizado para determinar esta variabilidad. En este trabajo, se logró la propagación de Lippia integrifolia (Gr.) Hie ("incayuyo") con 2,2 µM de bencilaminopurina añadido al medio Murashige-Skoog. Los brotes fueron recuperados a partir del desarrollo de meristemas axilares y a través de la generación de brotes de novo regenerados a partir de callos organogénicos. Las plantas regeneradas fueron llevadas a un campo experimental, cercano a su hábitat natural, para su evaluación. Dado que se detectaron variantes fenotípicas en las plantas regeneradas, se estudió la variabilidad genética de los dos tipos de materiales recuperados a través de microsatélites anclados. Se utilizaron trece marcadores, detectándose polimorfismos con todos los iniciadores ensayados en ambos tipos de plantas recuperadas. La existencia de polimorfismos implica que la estabilidad genética debe ser evaluada en todas las plantas recuperadas. El protocolo aquí desarrollado es el primer paso para la aplicación de biotécnicas para el mejoramiento de “incayuyo". Por otra parte, este es el primer trabajo en L. integrifolia donde se emplean marcadores moleculares