Caracterización fenotípica, citogenética y molecular de poblaciones naturales de Chrysolaena flexuosa (Sims) H. Rob en el sudeste bonaerense

Abstract

Chrysolaena flexuosa (Sims) H. Rob. (Asteraceae, Vernonieae) es una especie nativa de Sudamérica que se distribuye desde el centro-sur de Brasil hasta el centro-este de la Argentina y posee como número básico de cromosomas x=10. Para el área principal de su distribución fueron reportados citotipos diploides (2n=2x=20) y tetraploides (2n=4x=40); mientras que para el área más austral –provincia de Buenos Aires, Argentina- sólo se dispone de un registro correspondiente a un citotipo hexaploide (n=30-32 ca.). Esta especie es un subfrútice con xilopodio que emite varas florales con llamativos capítulos de flores blancas a púrpuras, por lo que posee valor ornamental potencial. Para su eventual incorporación en programas de mejoramiento genético con miras a la obtención de cultivares, resulta necesario contar con variabilidad genética para caracteres morfológicos de valor ornamental. Sin embargo, no se dispone de información de este tipo que facilite el trabajo de los fitomejoradores. Consecuentemente, en el siguiente trabajo se realizó una caracterización fenotípica, citogenética y molecular de poblaciones naturales de Ch. flexuosa provenientes del área de distribución en la Argentina para investigar si: (1): poseen variabilidad genética; (2) la ploidía y la latitud se relacionan positivamente; (3) la poliploidización sexual puede haber sido instrumental en el origen de los citotipos poliploides. A partir de semillas de siete introducciones (muestras poblacionales) de Ch. flexuosa, procedentes de las provincias de Buenos Aires (cuatro), Entre Ríos (una), Corrientes (una) y Misiones (una), se obtuvieron plantas que fueron llevadas al aire libre en un lote en Balcarce, (sudeste de la Pcia. de Buenos Aires, Argentina), bajo un DBCA (n=4; 15-24 plantas/introducción). En ellas se registró la fenología y 26 caracteres cuali- y cuantitativos de valor ornamental, en dos ciclos de crecimiento: período 2012/13 (ciclo 1) y período 2013/14 (ciclo 2). Para la obtención de los caracteres moleculares se emplearon marcadores de tipo AFLP. También se determinó el número cromosómico, contenido de ADN, y tamaño y viabilidad de polen, y se analizó la microesporogénesis en una muestra de las poblaciones. Con los datos recabados se realizaron análisis de tipo univariado empleando modelos lineales mixtos. A su vez, se realizaron análisis multivariados y AMOVA, y se empleó el índice Fst de Wright para evaluar la diversidad genética de las introducciones. El porcentaje de plantas en flor fue mayor en el ciclo 2 que en el ciclo 1. A su vez, el período de floración promedio fue más corto en este segundo ciclo (66,8 vs. 72,6 días, respectivamente), y ocurrió anticipadamente con respecto al primer ciclo (octubre–marzo vs. enero-mayo, respectivamente). En la caracterización morfológica se detectó variabilidad inter- e intrapoblacional para las variables evaluadas. Algunos caracteres exhibieron interacción introducción × ambiente. En todas las introducciones aumentó el número de hojas y de varas florales en ciclo 2. Las introducciones más australes -procedentes de Buenos Aires- presentaron, en general, menor número de hojas, de varas florales y de capítulos que las del NE, así como hojas y capítulos más grandes. Con respecto a la caracterización citogenética, las introducciones del NE resultaron diploides y tetraploides; mientras que las introducciones más australes resultaron hexaploides. El nivel de ploidía determinado a partir de conteos cromosómicos coincidió con lo obtenido mediante citometría de flujo; y se observó que el tamaño genómico se redujo significativamente con la ploidía. Todas las introducciones presentaron variabilidad en viabilidad y tamaño de polen, así como producción de granos de polen grandes (presumiblemente polen 2n). Esta variabilidad fue acompañada por eventos citológicos anormales en meiosis y en el estadio de tétrada. Por otra parte, el análisis multivariado conjunto de caracteres morfológicos y ploidía diferenció las introducciones en tres grupos: (1) Buenos Aires, (2) Entre Ríos, y (3) Corrientes y Misiones. El análisis multivariado combinando caracteres morfológicos, moleculares y ploidía sustentó la separación de las introducciones en función del origen geográfico, aunque de forma menos marcada. A su vez, los genotipos diploides presentaron menor tamaño de órganos que los poliploides. En el AMOVA las diferencias entre regiones geográficas no resultaron significativas (p=0,123) y el mayor porcentaje de la varianza molecular correspondió a la variación intrapoblacional (88,1%). El índice Fst=0,11 indicó moderada diferenciación genética entre introducciones. El mayor porcentaje de plantas en flor y la aceleración de la floración en el ciclo 2 estarían influenciados por el mayor desarrollo de las plantas y consecuente aumento de la concentración de sacarosa, que favorecerían la respuesta a las señales inductoras de la floración. El aumento en el número de hojas y de varas florales en ciclo 2 se relacionó con el aumento del tamaño del xilopodio que presentó más yemas que en el ciclo 1. Otros caracteres, como número de capítulos y de ramas, mostraron comportamiento de tipo cualitativo. Los resultados indican que, aparentemente, la ploidía y la latitud estarían relacionados, y que la poliploidización sexual puede haber sido instrumental en el origen, establecimiento y expansión de las poblaciones de Ch. flexuosa. A pesar de que algunos caracteres morfológicos resultaron exclusivos para cada introducción (posiblemente debido a fijación de alelos), la proximidad entre poblaciones facilitaría el flujo génico entre las mismas, con el intercambio interpoblacional de alelos. Por otra parte, la técnica AFLP resultó apropiada para la detección de variabilidad genética en las introducciones analizadas. Para concluir, la detección de variabilidad morfológica, citogenética y molecular en las introducciones estudiadas permitirían incorporar este germoplasma en programas de mejoramiento genético con fines ornamentales con buenas probabilidades de éxito en la obtención de cultivares comerciales. Además, la gran variabilidad morfológica detectada pone de manifiesto la importancia de observar un número representativo de plantas por población al realizar descripciones de esta especie, ya que los valores extremos observados supera en mucho los informados en la literatura.

Chrysolaena flexuosa (Sims) H. Rob. (Asteraceae, Vernonieae) is a South American species, with a basic chromosome number of x=10. Natural populations of this species have been found from southern Brazil to central Argentina, being Buenos Aires province the southern limit of its distribution. Diploid (2n=2x=20) and tetraploid (2n=4x=40) cytotypes have been reported for its distribution area, although one hexaploid (n=30-32 ca.) cytotype has been reported for its most southern distribution. It is a perennial xylopodial wild herb, with an atypical inflorescence with a zig-zag branching pattern and a palette of flower colors, from pure white to deep purple, of potential ornamental value. To incorporate this species in breeding programs for developing commercial cultivars, it is necessary to count with genetic variability for morphological characters of ornamental value. However, no information is available on this regard to facilitate the plant breeders´s activities. Consequently, in the following study, a phenotypic, cytogenetic and molecular characterization of natural populations of Ch. flexuosa from its distribution area in Argentina was carried out to investigate if (1): they were genetically variable; (2) ploidy and latitude were positively related; and (3) sexual polyploidization could have been instrumental in the origin of the polyploid cytotypes. Potted plants obtained from seeds of seven accessions (population samples), from the provinces of Buenos Aires (four), Entre Ríos (one), Corrientes (one), and Misiones (one), were grown outdoors in Balcarce, (Buenos Aires province, Argentina), under a CRBD (n=4, 15-24 plants/accession). Phenology and 26 qualitative and quantitative characters of ornamental value were recorded in two growth cycles: growing periods 2012/13 (cycle 1) and 2013/14 (cycle 2). AFLP markers were used for the molecular characterization. Chromosome numbers, DNA content, and pollen size and viability were also determined, and microsporogenesis was analyzed in a sample of each accession. Statistical analyses were performed, both univariate, using mixed linear models, and multivariate. Also an AMOVA was carried out and Wright's Fst index was used to evaluate the genetic diversity of the accessions. The percentage of flowering plants was higher in cycle 2 than in cycle 1. In turn, the average flowering period was shorter in this second cycle (66.8 vs. 72.6 days, respectively), and it occurred earlier than in the first cycle (October-March vs. January-May, respectively). In the morphological characterization, inter- and intrapopulation variability was detected. For some characters, introduction × environment interactions were detected. In all accessions, the number of leaves and inflorescences increased in cycle 2. The most southern accessions –from Buenos Aires province- had fewer leaves, inflorescences and heads than those from the NE, as well as larger leaves and heads. Regarding the cytogenetic characterization, accessions from Corrientes and Misiones were diploid, the one from Entre Ríos was tetraploid, and those from Buenos Aires were hexaploid. Ploidy levels determined both by chromosome counting and flow cytometry coincided, although the monoploid genome size significantly decreased with increasing ploidy. In all accessions, variability was observed for pollen viability and size, as well as for large (presumably 2n) pollen production. This variability was underlined by abnormal cytological events in meiosis and at the tetrad stage. On the other hand, multivariate analysis using morphological characters and ploidy level differentiated the accessions into three groups: (1) Buenos Aires, (2) Entre Ríos, and (3) Corrientes and Misiones. The multivariate analysis combining ploidy levels and morphological and molecular characters supported less markedly the separation of accessions according to geographical origin. In turn, diploid genotypes had smaller organ size than polyploids. In the AMOVA, the differences among geographic origin were not significant (p = 0.123) and the highest percentage of the molecular variance corresponded to intrapopulation variation (88.1%). The Fst= 0.11 index indicated moderate genetic differentiation between introductions. The higher percentage of flowering plants and the acceleration of the flowering period in cycle 2 would be influenced by the greater development of the plants and the consequent increase in sucrose concentration, which favored the response to flower induction. The increase in the number of leaves and inflorescences in cycle 2 was related to the increase in the size of the xylopodium, which presented more buds than in cycle 1. Other characters, such as number of capitulums and branches, exhibited qualitative behavior. The results would indicate that there is, apparently, a positive relation between ploidy and latitude, and suggest a likely role of sexual polyploidization in the origin, establishment and expansion of Ch. flexuosa populations. Although some morphological characters were exclusive for each introduction (possibly due to allele fixation), proximity between populations would facilitate gene flow between them, and interpopulation allele exchange. On the other hand, the AFLP technique was appropriate for detecting genetic variability in the analyzed accessions. To conclude, the detection of morphological, cytogenetic and molecular variability in the analyzed accessions would allow the incorporation of this germplasm in breeding programs with ornamental purposes, with good expectations of success in obtaining commercial cultivars. In addition, the large morphological variability detected highlights the importance of observing a representative number of plants per population when making descriptions of this species, since the extreme values observed do not coincide with those reported in the literature.