Inmunidad adaptativa y protectora contra el virus de la fiebre aftosa en bovinos : rol de las respuestas inmunes sistémica y de mucosas

Abstract

La fiebre aftosa (FA) es una enfermedad viral infectocontagiosa de curso agudo que se caracteriza por producir lesiones vesiculares en tejidos de la mucosa oronasal (incluyendo lengua, encías y paladar), ubres, espacios interdigitales y rodetes coronarios de las pezuñas de los animales infectados. Su agente etiológico, el virus de la fiebre aftosa (VFA), es un virus perteneciente a la familia Picornaviridae que afecta a animales biungulados, incluyendo por tanto a bovinos, porcinos, caprinos y ovinos domésticos, junto con numerosas especies silvestres que pueden actuar como reservorios bajo determinadas condiciones ecológicas. La virulencia, el amplio rango de huéspedes, la diversidad de variantes y la alta capacidad infecciosa y de contagio del VFA, explican su presencia y re-emergencia en diversas partes del mundo y la convierten en un problema sanitario de escala global. La enfermedad genera enormes pérdidas económicas a la industria ganadera debido al cierre obligado de los mercados externos y a pérdidas considerables en el mercado interno, asociadas a la disminución de la producción, al sacrificio y al bloqueo del movimiento de animales. En trabajos previos de nuestro grupo de investigación, se evidenciaron respuestas inmunes de anticuerpos tanto a nivel sistémico como en mucosas, observables luego de la infección con VFA, así como de la vacunación sistémica en bovinos, siendo su ocurrencia, por lo tanto, independiente de la ruta inicial de contacto con el antígeno viral. Dentro de este panorama, la contribución relativa a la inmunidad protectora de los diferentes mecanismos inmunes potencialmente implicados en la respuesta generada, es difícil de discernir. La presente tesis doctoral plantea como hipótesis de trabajo que los anticuerpos sistémicos, administrados mediante la inmunización pasiva de terneros seronegativos para VFA, son capaces de evitar la diseminación del virus luego de la infección por vía aerógena y en ausencia de otros mecanismos inmunes. Para esto, inicialmente se realizaron una serie de experimentos donde se ajustaron las condiciones para la inmunización pasiva contra el VFA en terneros. En estos procedimientos se utilizaron plasmas de bovinos vacunados con formulaciones tetravalentes comerciales anti-aftosa de serie. Los mismos fueron reunidos en una sola fracción y diferentes volúmenes de esta preparación fueron transferidos a terneros seronegativos. Una vez realizado el procedimiento, se midieron diversos parámetros de inmunidad humoral específicos contra el VFA, entre las 0 h y los 30 días post-transferencia. A partir de estos resultados, se determinó el volumen de plasma requerido para llevar a cabo la inmunización pasiva, así como los protocolos de administración y los tiempos adecuados para realizar las infecciones posteriores en los animales pasivamente inmunizados. Para el segundo experimento, se utilizaron vacunas monovalentes de la cepa O1/Campos de alta carga antigénica, con las que se inmunizaron bovinos seronegativos (n=8). Se obtuvo plasma de cuatro de estos animales a los 7 días post-vacunación (dpv) y a los 26 dpv en los cuatro restantes. Así se conformaron dos pooles de plasma inmunes (7 y 26 dpv) que diferían tanto en la composición isotípica de las inmunoglobulinas, así como en los títulos de anticuerpos totales y neutralizantes anti-VFA. En el caso del pool de plasma de 7 dpv el isotipo predominante detectado fue la IgM y el título de anticuerpos neutralizantes fue 1,6; mientras que para el pool de 26 dpv, se detectaron ambos subtipos de IgG (1 y 2) y niveles menores de IgM, con un título de anticuerpos neutralizantes de 2,7. Los animales pasivamente inmunizados se infectaron por vía oronasal y estos resultados se compararon con los obtenidos en animales vacunados e infectados a los mismos tiempos post-vacunación (7 y 26 dpv). Nuestros resultados demostraron que los anticuerpos circulantes previenen la generalización de la fiebre aftosa solo en el caso de los animales pasivamente inmunizados con plasma de 26 dpv, ya que los animales que recibieron el plasma de 7 dpv mostraron signos clínicos de la enfermedad luego de la infección aerógena. Esto indicaría que, en ausencia de otros mecanismos inmunitarios adaptativos preexistentes, los anticuerpos circulantes en sangre efectivamente son capaces de evitar el desarrollo de la enfermedad, aunque existe un umbral de título de anticuerpos por debajo del cual se desencadena la enfermedad luego de la infección oronasal. Para el caso de los animales vacunados, se obtuvo una protección total de los mismos, tanto en los infectados a los 7 como a los 26 dpv. Esto ocurrió aun cuando el animal vacunado 7 días antes de la infección presentaba, al momento del desafío, niveles de anticuerpos sistémicos neutralizantes similares a los de los animales inmunizados pasivamente con plasma de 7 dpv y que mostraron signos clínicos de fiebre aftosa post-infección. El estudio de las respuestas de anticuerpos post-infección, tanto a nivel sistémico como en mucosas respiratorias, indicó que la vacunación promovió la generación de una respuesta de anticuerpos rápida tras la exposición al virus, presentando la misma un perfil de respuesta de tipo secundaria. En ambos casos, los infectados a los 7 dpv o a los 26 dpv, mostraron rápidos cambios de los isotipos predominantes de las inmunoglobulinas VFA-específicas, así como un aumento de los títulos de anticuerpos y de la avidez en los sueros obtenidos post-infección. Interesantemente, estas observaciones se verificaron tanto a nivel sistémico como local, en linfonódulos drenantes del tracto respiratorio. En conjunto estos resultados indican que los anticuerpos circulantes pueden ser suficientes para evitar la generalización de la enfermedad en bovinos infectados por la vía oronasal, aun en ausencia de otros mecanismos activos de inmunidad específica. A su vez, la caracterización de las respuestas de anticuerpos posteriores al desafío, tanto a nivel sistémico como local, reveló que la inmunización sistémica con vacunas convencionales anti-aftosa promovió rápidamente un aumento del título de anticuerpos, así como de la avidez de los sueros inmunes y la modificación en los isotipos en las inmunoglobulinas predominantes, todos cambios asociables a respuestas anamnésicas contra el virus. Se resalta el carácter protector de que estos procesos frente al establecimiento de la enfermedad, y el hecho que los mismos se verificaron en tiempos muy cercanos a la vacunación (7 dpv) y aun cuando la infección aerógena se realizó en presencia de títulos bajos de anticuerpos neutralizantes.

Foot-and-mouth disease (FMD) is an acute infectious viral disease characterized by producing vesicular lesions in tissues of the oronasal mucosa (including the tongue and palate), udders, interdigital spaces and coronary runners of the hooves of infected animals. Its etiological agent, the foot-and-mouth disease virus (FMDV), is a virus belonging to the Picornaviridae family that affects cloven-hoofed animals, including cattle, pigs, goats and domestic sheep, along with numerous wild species that can act as reservoirs under certain ecological conditions The virulence, the wide range of hosts, the diversity of variants and the high infectious and contagious capacity of FMDV, explain their presence and re-emergence in various parts of the world and make it a sanitary problem of scale global. The disease generates enormous economic losses to the livestock industry due to the forced closure of external markets and considerable losses in the domestic market, associated with the reduction of production, slaughter, and blockage of animal movement. Previous results of our laboratory described the onset of the mucosal and systemic immunity in cattle not only after FMDV aerosol infection but also after systemic vaccination, showing that the response is independent of the initial route of contact with the virus. Despite this, the contribution of each immune mechanism implicated in the immune response is not clear yet. The present work is based on the hypothesis that the systemic antibodies circulating after a passive immunization in cattle are sufficient to prevent disease generalization after oronasal infection and in absence of additional immune mechanisms. To this end, a series of experiments were initially carried out to adjust the conditions for the passive immunization against FMD in seronegative calves. In these procedures, calves sera from cattle vaccinated with commercial tetravalent formulations were used. From these results, the volume of serum required to make the passive immunization was determined, as well as the administration protocols and the time available to perform the subsequent infections in the passively immunized animals. For the final experiment, naïve animals (n=8) received one dose of a single-oil-emulsion monovalent vaccine containing FMDV O1/Campos strain. We used two different preparations of FMDV- specific immune serum, obtained at 7 and 26 days post-vaccination (dpv), differing therefore in the immunoglobulin isotype composition and seroneutralization titers. Serum 7 dpv pool had a titer of neutralizing antibodies of 1.6 and the isotype predominantly on its composition was IgM, while titer of serum 26 dpv pool was 2.7 and both subtypes- IgG1 and IgG2- were detected in the pool and in less concentration IgM. After passive immunization, animals were infected by oronasal infection with FMDV O1C strain and these results were compared with animals infected 7 and 26 days after vaccination. Our results demonstrated that systemic antibodies were enough to prevent the disease generalization only in the case of animals transferred with serum 26 dpv, since animals transferred with serum 7 dpv showed clinical symptoms of the disease after oronasal infection. This might suggest that in absence of other preexisting adaptive immune mechanisms, circulating antibodies are able to prevent the progress of the disease despite there is a threshold titer of antibodies below which the disease is triggered after oronasal infection. Animals infected after vaccination were all protected, including the animal vaccinated and infected 7 dpv even though when the neutralizing antibody titers were similar to those of the animals passively immunized with serum 7 dpv and which showed clinical symptoms after oronasal infection. The study of post-infection antibody responses, both systemic and mucosal, indicated that vaccination promoted the generation of a rapid antibody response after exposure to the virus, presenting a secondary response profile. In both cases, those infected at 7 dpv or at 26 dpv showed rapid changes of the predominant isotype of the FMDV-specific immunoglobulins, as well as an increase in antibody titers and avidity in sera obtained post-infection. Interestingly, these observations were verified both at the systemic and local level, in draining lymph nodes of the respiratory tract. Overall, these results indicate that circulating antibodies may be sufficient to prevent the generalization of the disease in bovines infected by the oronasal route, even in the absence of other active mechanisms of specific immunity. In turn, the characterization of post-challenge antibody responses, both at systemic and local level, revealed that systemic immunization with conventional anti-FMDV vaccines rapidly promoted increases in antibody titers and avidity of the immune serum, accompanied by a change of the isotype profile towards the IgG1 subclass, all changes associated with anamnestic responses against the virus. Interestingly, such protective responses occurred very early after vaccination (7 dpv) and even when the aerogenic infection was performed in the presence of low titers of FMDV-neutralizing antibodies.