Tolerancia a frío en estadios tempranos del desarrollo en arroz: caracterización fenotípica de germoplasma de origen diverso y variación alélica en genes candidatos

Abstract

El arroz es una especie de clima templado-subtropical a subtropical susceptible a bajas temperaturas durante las etapas iniciales del desarrollo. Si bien en el mundo existen materiales tolerantes, actualmente no se dispone de materiales de este tipo adaptados a la región arrocera argentina, con los que se podría adelantar la fecha de siembra, hacer coincidir la floración con el momento de máxima radiación solar y aumentar el rendimiento. Ya se ha realizado el mapeo de la tolerancia a bajas temperaturas al estado de plántula en poblaciones segregantes y el mapeo fino de un QTL asociado al carácter. A su vez se han propuesto varios genes candidatos, entre ellos OsGSTZ1, OsGSTZ2 y OsCDPK13. En el presente trabajo se caracterizó fenotípicamente un grupo de líneas endocriadas de arroz y se analizó la variación alélica en los tres genes candidatos mencionados. Se determinó la supervivencia de plántulas y el porcentaje de germinación de 116 líneas de origen diverso (incluidos testigos tolerantes y susceptibles y líneas avanzadas del programa de mejoramiento de la EEA Corrientes-INTA) en condiciones controladas de bajas temperaturas. Como resultado, los testigos empleados tuvieron una respuesta acorde a lo esperado. Además, tanto en el estadio de plántula como en la germinación se detectaron líneas de comportamiento similar a los testigos, intermedio entre testigos tolerantes y susceptibles y más extremo, pero no se halló correlación entre ambos estadios. Para analizar la variación alélica se seleccionaron las diez líneas con respuesta más contrastante para el carácter (cinco susceptibles y cinco tolerantes) y se amplificó la región codificante con iniciadores específicos. Posteriormente se secuenciaron los productos de PCR y se analizaron las secuencias obtenidas. Para cada uno de los fragmentos se alinearon las secuencias obtenidas con las correspondientes secuencias de referencia (ADN genómico y ADNc de arroz en bases de datos públicas). Se analizó la densidad de polimorfismos de nucleótido simple (“SNPs”) e inserciones/deleciones (“indels”), y se encontró un total de 34 polimorfismos en los tres genes (28 SNPs y seis indels). Ocho SNPs y un indel separaron a las líneas según su fenotipo. Dos de los SNPs se localizaron en exones, uno se detectó en la región no traducida 3‟, y los restantes SNPs y el indel se hallaron en intrones. Para los SNPs hallados en exones se determinó la ubicación de la base polimórfica en el codón y se realizó la traducción de la región codificante a proteína para determinar el tipo de cambio producido. Únicamente uno de los SNPs (A>G), ubicado en el gen OsGSTZ2, resultó en un cambio de aminoácido (Ile>Val). La presencia de este SNP en las líneas analizadas indicaría una asociación del alelo G con la sensibilidad a bajas temperaturas. No obstante, debería verificarse si dicha asociación se mantiene en un mayor número de genotipos. Los resultados del presente estudio indican que se cuenta con amplia variabilidad para la tolerancia a frío en estadios tempranos del desarrollo en líneas de arroz adaptadas a condiciones locales, aunque es necesario determinar si la respuesta observada en condiciones controladas es reproducible a campo.

Rice is a crop from tropical and subtropical areas, susceptible to low temperatures during early growth stages. Whereas there are genetic materials with cold tolerance, these have been developed for other conditions than those occurring in Argentina‟s rice growing area, or their grain type is not suitable for the local market. If such locally adapted varieties were available, growers could anticipate sowing date, make flowering time coincide with the moment of maximum solar radiation and increase yields. Mapping of tolerance to low temperatures at the seedling stage in segregant populations and fine mapping of a QTL associated with the trait have been achieved recently. In turn, several candidate genes have been proposed, including OsGSTZ1, OsGSTZ2 y OsCDPK13. In this work, a group of rice inbred lines was phenotypically characterized, and allelic variation in the three candidate genes mentioned above was analyzed in a subset of such materials. Seedling survival and germination percentage of 116 materials of diverse origin (including tolerant and susceptible controls and advanced lines from EEA Corrientes-INTA‟s breeding program) were determined under controlled, low temperature conditions. As a result, those materials used as controls responded to cold as expected. In addition, materials with behavior similar to controls, intermediate between susceptible and tolerant controls and more extreme than controls were detected at both seedling stages and, germination but no correlation was found between stages. Those genetic materials with the most contrasting response to cold (five tolerant and five susceptible materials) were selected to analyze allelic variation at candidate genes. The coding region of genes OsGSTZ1, OsGSTZ2 y OsCDPK13 was amplified by PCRusing specific primers. Subsequently, PCR products were sequenced and the sequences obtained were analyzed. Sequences were aligned with rice genomic DNA and full cDNA sequences, available in public databases. Density of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and of insertions/deletions ("indels") was assessed, and a total of 34 polymorphisms was found in the three genes (28 SNPs and six indels). Seven SNPs and an indel separated genetic materials by their phenotype (susceptible or tolerant). Two of these SNPs were located in exons, one SNP was found in the 3‟ UTR region and the remaining SNPs and the indel were found in introns. The location of the polymorphic base in the codon was determined for the SNPs found in exons, and the translated sequence was inspected for aminoacid changes. Only one of the SNPs (A> G) located in gene OsGSTZ2 resulted in an aminoacid change (Ile> Val). Apparently, the presence of this SNP in the materials studied indicates an association of the G allele with sensitivity to low temperatures, although this should be examined in a larger number of genotypes. The results of the present study indicate that wide variability for cold tolerance at early growth stages in rice is available in advanced breeding materials that are adapted to local growing conditions. However, whether the response observed under a controlled environment is reproducible in field conditions remains to be ascertained.