Obtención y evaluación de nuevos materiales de pasto llorón (Eragrostis curvula - Schrad. Nees) y desarrollo de protocolos biotecnológicos para su utilización en programas de mejoramiento de la especie

Abstract

E. curvula (Schrad.) Nees “pasto llorón”, es una gramínea perenne que constituye un importante recurso forrajero para regiones semiáridas. El objetivo general de este trabajo de tesis fue contribuir al mejoramiento del pasto llorón a partir de dos estrategias. La primera consistió en la obtención de nuevos materiales híbridos a partir de cruzamientos entre materiales sexuales y apomícticos y evaluar sus características moleculares y agronómicas. Por otro lado, se intentó poner a punto un protocolo de transformación genética, basado en Agrobacterium tumefaciens, que permita contribuir al mejoramiento de la calidad del forraje por regulación negativa de la biosíntesis de lignina y que sea una herramienta para la validación de genes relacionados con el modo reproductivo. En este trabajo se realizaron 15 cruzamientos entre OTA-S USDA y Tanganyika USDA, ambos tetraploides, siendo el primero sexual y el segundo apomíctico. De estas cruzas se obtuvo un total de 2063 semillas de las cuales solo germinó el 39,31% y de este, solo se obtuvo un 15,85% de plantas normales. Se extrajo ADN de las plantas normales a fin de proceder a determinar la naturaleza híbrida de las mismas. Se utilizaron AFLPs y EST-SSR. Se obtuvieron 691 marcadores de AFLP de los cuales 317 fueron polimórficos. Con estos análisis se determinó que de las 232 plantas analizadas, solo seis resultaron de origen híbrido, es decir que portaban bandas paternas. El resto de las plantas obtenidas provenían de autofecundación del progenitor femenino OTA USDA por efecto mentor del polen del material apomíctico. Esto fue un resultado inesperado, dada la autoincompatibilidad de este genotipo. El segundo análisis con marcadores moleculares, fue realizado con el objetivo de buscar variabilidad dentro del complejo de plantas no hibridas obtenidas. En este caso se analizaron seis combinaciones de primers de marcadores de AFLPs, con los cuales se obtuvieron 376 marcadores en total, de los cuales 46 resultaron ser polimórficos. Se observó variabilidad a nivel molecular y en caracteres morfológicos y agronómicos; el progenitor masculino se diferenció a ambos niveles de las demás plantas; las plantas hijas fueron más similares a la madre aunque algunas la superaron en caracteres de interés. La distancia genética observada entre el progenitor femenino y el masculino pudo haber afectado la obtención de plantas híbridas. El bajo porcentaje de germinación (39%) observado y la elevada mortalidad de plántulas, podría también atribuirse a este factor, correspondiendo las semillas no germinadas y las plantas anómalas a híbridos no viables. Por último, se realizaron 23 ensayos para la transformación de pasto llorón utilizando dos cepas de Agrobacterium tumefaciens que difieren en su capacidad de virulencia, AGL0 y AGL1, ambas conteniendo el vector binario (Ppzp201BUGI). Se inoculó un total de 8428 semillas maduras bajo diferentes condiciones experimentales. Se obtuvo un protocolo de transformación transiente para pasto llorón a partir de semillas maduras. Deberán ajustarse algunas variables a fin de obtener un protocolo de transformación estable.

E. curvula (Schrad.) Nees "weeping lovegrass", is a perennial grass that is an important forage resource for semiarid regions. The overall objective of this thesis was to contribute to the improvement of weeping lovegrass from two strategies. The first involved the development of new hybrid materials from crosses between sexual and apomictic materials and to assess its molecular and agronomic characteristics. On the other hand, we tried to develop a protocol for genetic transformation, based on Agrobacterium tumefaciens, that could contribute to improve forage quality through downregulation of lignin biosynthesis and as a tool for validation of genes related to the reproductive mode. In this work 15 crosses between OTA-S and Tanganyika, both apomictic tetraploid materials, were perform and 2063 seeds were obtained. After two months only the 39.31% of these seeds geminated and 15.85% of these seeds gave origin to viable plants. DNA of these plants was isolated in order to assess the hybrid origin of these plants and also to analyze the variability present in the obtained plant population. EST-SSR and AFLP markers were used with this purpose and 691 AFLP markers were amplified, of which 317 were polymorphic. With these markers it could be established that from 232 analyzed plants, only six were true hybrids. This would indicate that the remaining plants were obtained by self-fertilization of the female parent OTA-S. This was an unexpected result, given the self-incompatibility of this genotype. The second analysis was performed in order to assess the variability within the obtained plant population. Six AFLPs primer combinations allowed to amplify 376 markers of which 46 were polymorphic. A high level of variation was observed at molecular, morphological and agronomic traits; the male parent differed significantly from the other plants at all levels being the offspring plants very variable and similar to the maternal plant and, is some instances superior to this plant in different interesting traits. These results also allowed to assess that the genetic distance between the female and the male parents may have affected the production of hybrid plants. The low percentage of germination (39%) and the high seedlings mortality could also be attributed to this factor.. Finally, 23 transformation assays were performed in order to establish a plant transformation protocol for weeping lovegrass using two Agrobacterium tumefaciens strains differing in its virulence (AGL1 and AGL0) and containing the binary vector Ppzp201BUGI. A total of 8428 mature seeds were inoculated and different treatments were performed changing different parameters in order to establish the best conditions for inoculation and plant regeneration. It was not possible to obtain a protocol for stable transformation but a transient transformation protocol was obtained from mature seeds. Some variables should be adjusted in order to obtain a stable and reliable transformation protocol for weeping lovegrass.