Estudio del efecto del uso de anticuerpos específicos contra el virus de la leucosis bovina como suplemento dietario en terneros

Abstract

En este trabajo se estudió el efecto del uso de anticuerpos de yema de huevo (IgY) anti BLV específicos como suplemento en la leche de consumo de terneros durante todo el período de cría, monitoreando a los animales desde el nacimiento hasta los 9 meses de vida. El objetivo central fue obtener evidencia que el consumo de leche pueda ser una vía de transmisión del virus y si así fuera, proponer una alternativa para interferir con el desafío natural de infección por BLV por consumo de leche. Como objetivo complementario, se realizaron infecciones experimentales en ovinos en las que se determinó la dosis mínima infectiva tanto de virus asociado a células FLKBLV como de virus libre en sobrenadante celular de FLK-BLV. También se analizó la capacidad neutralizante de los anticuerpos presentes en suero de un animal infectado con BLV. Cabe destacar que previamente al uso de animales se intentó poner a punto un ensayo in vitro. Se realizó la caracterización del rodeo donde se desarrolló la experiencia con terneros. Se observó una prevalencia individual de anticuerpos del 96% en las muestras de sangre, y de un 90% en las muestras de leche. Los títulos de anticuerpos en sangre fueron significativamente más altos que los encontrados en leche. Se detectó la presencia de provirus en el 82% de las muestras de sangre y 59% de las muestras individuales de leche. La carga proviral en leche fue significativamente menor que en sangre. En la leche de tanque del ordeñe diario, se encontraron anticuerpos con un título de 1:32 en todas las muestras, mientras que en las muestras de leches individuales el rango de títulos de anticuerpos variaba entre <1:16 y >1:64. Al comparar las leches individuales con un título de 1:32 con las leches de tanque que poseen el mismo título, se pudo observar que el 90% de las leches de tanque evidencian cargas provirales detectables, mientras que solo el 60% de esas leches individuales evidencian carga proviral detectable. Se detectaron anticuerpos anti BLV en el 95,5% de los terneros recién nacidos, lo que demostraría un correcto calostrado de los animales, de los cuales el 13% de los terneros nacieron infectados (detección de provirus en sangre). En el bioensayo de ovinos, se observó que fueron necesarias 5.000 células FLK-BLV por inoculo para generar la infección en los dos corderos inoculados, mientras que el virus libre en sobrenadante celular FLK-BLV resultó infectivo hasta la dilución 1/1.000. El suero bovino positivo a BLV impidió la infección en los corderos inoculados con el virus libre de células, mientras que todos los ovinos se infectaron cuando se inocularon con virus libre de células en presencia de suero bovino negativo a BLV. Se produjo la cantidad necesaria de un preparado de polvo de huevo con anticuerpos específicos anti BLV para el ensayo controlado de eficacia a campo. La preparación fue caracterizada por ELISA y por infección experimental en corderos. Todos los corderos resultaron infectados cuando fueron inoculados con virus libre de células FLK-BLV previamente incubado con la preparación de IgY concentrada anti BLV y con la preparación de polvo de huevo anti BLV, no demostrando la capacidad de las IgY anti BLV de neutralizar el virus presente en el sobrenadante de células FLK-BLV. Si bien el ensayo in vivo fue una alternativa para el ensayo in vitro con el objeto de analizar la capacidad neutralizante de los anticuerpos IgYs, y aunque no se obtuvieron los resultados esperados, su realización ha resultado beneficiosa para el grupo de trabajo, como una herramienta nueva y válida para realizar distintos estudios. Este polvo fue suministrado a los terneros en cada toma de leche durante la cría. Paralelamente en un grupo control, no se les ofreció ningún suplemento en las tomas diarias de leche. En los primeros días de vida de los terneros se observó tanto en el grupo control como en el grupo tratado, anticuerpos en el 93% de las muestras. Estos valores concuerdan con lo previamente reportado para infecciones en terneros recién nacidos. Los siguientes muestreos se realizaron hasta completar el seguimiento a los 9 meses de los terneros en donde se observó una prevalencia del 6.6% en el grupo tratado y del 7.7% en el grupo control. Este trabajo de tesis aportó datos sobre la epidemiologia natural de la infección, que deberían ser utilizados para el diseño y prosecución de una estrategia de control. En un contexto de infección natural francamente endémica, la estrategia de uso de anticuerpos como complemento en la toma diaria de leche podría ser valiosa para la reducción de la dinámica en la edad temprana.

In this work we studied the effect of the use of anti-BLV specific egg yolk antibodies (IgY) as a supplement in the milk of calves during the whole breeding period, monitoring the animals from birth to 9 months of age. The main objective was to obtain evidence that milk consumption could be a route of transmission of the virus and if so, to propose an alternative to interfere with the natural challenge of BLV infection due to milk consumption. As a complementary objective, experimental infections were carried out in sheep in which the minimum infectious dose was determined both of FLK-BLV cell-associated virus and of free virus in FLK-BLV cell supernatant. The neutralizing capacity of the antibodies present in the serum of an animal infected with BLV was also analyzed. It should be noted that prior to the use of animals an attempt was made to develop an in vitro assay. The characterization of the herd where the experience with calves was developed was carried out. An individual antibody prevalence of 96% was observed in blood samples and 90% in milk samples. The antibody titers in blood were significantly higher than those found in milk. The presence of provirus was detected in 82% of the blood samples and 59% of the individual milk samples. The proviral load in milk was significantly lower than in blood. In the milk of the milking tank, antibodies were found with a titer of 1:32 in all the samples, whereas in the samples of individual milks the range of antibody titers varied between <1:16 and> 1:64. When comparing the individual milks with a titer of 1:32 with the tank milks that possess the same title, it could be observed that 90% of the tank milks show detectable proviral loads, while only 60% of those individual milks evidence detectable proviral load. Anti-BLV antibodies were detected in 95.5% of the newborn calves, showing a correct colostrum intake, where 13% of the calves were born infected (detection of provirus in blood). In the sheep bioassay, it was observed that 5,000 FLK-BLV cells were enough to generate the infection in the two lambs inoculated, while the free virus in FLK-BLV cell supernatant was infective until dilution 1/1000. BLV-positive bovine serum prevented infection in lambs inoculated with cell-free virus, whereas all sheep were infected when inoculated with cell-free virus in the presence of BLV-negative bovine serum. The necessary amount of an egg powder with specific anti-BLV antibodies was produced for the controlled field efficacy test. The preparation was characterized by ELISA and by experimental infection in lambs. All lambs were infected when they were inoculated with 7FLK-BLV cell-free virus previously incubated with the concentrated anti-BLV IgY preparation and with the BLV egg powde, not demonstrating the ability of the anti-BLV IgY to neutralize the virus present in the supernatant of FLK-BLV cells. Although the in vivo test was an alternative for the in vitro test in order to analyze the neutralizing capacity of the IgYs antibodies, and although the expected results were not obtained, it has been beneficial for the group, as a new and valid tool to carry out different studies. This powder was supplied to the calves in each milk intake during breeding. In parallel in a control group, no supplement was offered in the daily milk intakes. In the first days of life of the calves, 93% of the samples contained antibodies both in the control group and in the treated group. These values agree with what was previously reported for infections in newborn calves. The following samplings were carried out until the 9-month follow-up of the calves was completed, where a prevalence of 6.6% and 7.7% was observed in the treated and in the control group, respectively. This thesis provided data on the natural epidemiology of the infection, which should be used to design and pursue a control strategy. In a context of endemic natural infection, the strategy of using antibodies as an adjunct in the daily milk intake could be valuable for the reduction of the dynamics in the early age.