Prevención y tratamiento de Rotavirus A mediante nanoanticuerpos VHH anti-VP6

Abstract

La diarrea asociada a Rotavirus A (RVA) representa una de las principales causas de mortalidad infantil a nivel mundial. Si bien la vacunación masiva contra RVA ha logrado disminuir significativamente las muertes causadas por este patógeno, la disponibilidad y la eficacia de las vacunas en zonas de bajos recursos es limitada. Por otra parte, el manejo clínico de la infección por RVA se basa en la administración de Sales de Rehidratación Oral (SRO), mientras que las opciones terapéuticas específicas resultan limitadas. El principal objetivo de este trabajo fue estudiar y optimizar la utilización de dos fragmentos correspondientes a la porción variable de anticuerpos de cadena pesada derivados de llama (VHH) dirigidos contra la proteína VP6 – 2KD1 y 3B2– para la prevención y el tratamiento de la diarrea asociada a RVA y comparar su eficacia respecto de otras opciones terapéuticas disponibles. En primer lugar, se analizó la eficacia de ambos clones de VHH anti-VP6 para la prevención y el tratamiento de la diarrea inducida por RVA en un modelo de ratón (BALB/c) lactante inoculado con una cepa virulenta de RVA murino (EcW, G16P[16]I7). En el tratamiento profiláctico, los VHH fueron administrados oralmente dos horas antes de la inoculación viral mientras que en el tratamiento terapéutico, los VHH fueron administrados oralmente luego de la inoculación viral, tanto en forma previa a la aparición de los síntomas (pre-sintomático) como luego de la ocurrencia de diarrea (post-sintomático). En todos los casos, ratones lactantes de cuatro días de vida fueron inoculados con 1778 DD50 (Dosis Diarrea 50) de RVA murino a los 0 Días Post Inoculación (DPI) y examinados diariamente para determinar la ocurrencia de diarrea y recolectar muestras de heces. Los ratones tratados y el control no tratado fueron sacrificados en forma secuencial entre los 0 y los 6 DPI para el tratamiento profiláctico y los 0 a 7 DPI en el caso de los tratamientos terapéuticos pre y post-sintomáticos. Luego de la eutanasia, se colectaron muestras de intestinos y de suero. 1. Ensayos profilácticos. Se evaluó la eficacia de dos dosis de VHH, utilizando cuatro camadas de ratones lactantes para cada tratamiento diario: 160 μg de 2KD1+3B2 (N = 31) y 200 μg de 2KD1+3B2 (N = 30). En ambos casos, el tratamiento comenzó a los -1 DPI y continuó hasta los 6 DPI. En el DPI 0, los VHH fueron administrados dos horas antes de la inoculación viral. Los controles incluidos fueron ratones inoculados no tratados (control no tratado) y ratones no inoculados (control normal). 2. Ensayo terapéutico pre-sintomático. Se evaluaron cuatro tratamientos orales: 160 μg de 2KD1+3B2 (80 μg de cada uno) (N = 25), 200 μg de 2KD1+3B2 (100 μg de cada uno) (N = 28), 200 μg de 3B2 (N = 24), 200 μg de 2KD1 (N = 30). Para ambos ensayos, se determinó también la presencia de anticuerpos anti-RVA en muestras de sueros e intestino a los 0, 7 y 40 DPI. Asimismo, se evaluó el surgimiento de una respuesta inmune humoral contra el tratamiento de VHH por medición de anticuerpos anti-VHH intestinales y séricos a esos tiempos y el posible surgimiento de mutantes virales de escape al tratamiento mediante PCR, secuenciación completa y análisis filogenéticos del gen codificante de VP6 en muestras de intestinos y heces positivas para RVA luego de 4-6 días de tratamiento. Los resultados obtenidos mostraron que ambas dosis profilácticas de 2KD1+3B2 redujeron significativamente la duración y la severidad de la diarrea al igual que el título infeccioso en intestino y la excreción viral en heces. En relación al tratamiento terapéutico pre-sintomático, la administración conjunta de 2KD1 y 3B2 (200 μg) redujo significativamente la duración y severidad de la diarrea, la infección intestinal y la excreción fecal en relación al grupo no tratado. Mientras que la misma dosis de 2KD1 o 3B2 (200 μg) también redujo la duración de la diarrea por RVA con respecto al control, 2KD1 resultó más efectivo en la disminución de la infección intestinal y la excreción de RVA en heces. Si bien ambos clones presentaron amplia actividad neutralizante contra diferentes cepas de RVA in vitro, el clon 2KD1 requirió menores concentraciones que 3B2 para neutralizar algunas variedades, en particular la cepa de RVA murino usada en los ensayos previos. Asimismo, 2KD1 presentó valores de afinidad por las partículas de RVA tres veces mayor que 3B2 (EC50). Ni el tratamiento profiláctico ni el tratamiento terapéutico pre-sintomático con VHH anti-VP6 interfirieron con la respuesta inmune humoral del hospedador frente a RVA. Tampoco se detectaron mutantes virales de escape al tratamiento a nivel de la proteína VP6 en ningún caso. Tratamiento terapéutico post-sintomático. En este caso, los ratones fueron inoculados con 1778 DD50 de RVA murino al cuarto día de vida como ya fuera descripto y recibieron un tratamiento diario de 200 μg de 2KD1 a partir de los 2 DPI, cuando todos los ratones presentaban diarrea, hasta los 7 DPI. El tratamiento terapéutico post-sintomático con 200 μg de 2KD1 redujo la infección intestinal por RVA y la excreción viral en heces en relación al control no tratado. Aunque hubo una tendencia a reducir la duración de los síntomas, las diferencias no fueron significativas. Con el objetivo de evaluar la prevención de la diarrea por RVA en un modelo de administración continua de los VHH, se realizó un nuevo ensayo involucrando ratonas transgénicas que expresaban los VHH anti-VP6 (2KD1+3B2) en leche materna, regulados bajo el promotor del Virus de Tumor Mamario Murino. En este caso, los ratones fueron inoculados a los cuatro días de vida con una dosis menor de RVA murino (800 DD50) y se utilizaron cuatro camadas de ratones transgénicos amamantados por madres transgénicas y cuatro camadas de ratones wild type amamantados por madres wild type como control. Para descartar que la transgénesis de los ejemplares pudiera tener un efecto sobre el desarrollo de la enfermedad por RVA, se efectuó un ensayo de cross-fostering en el cual las progenies de cuatro madres transgénicas fueron amamantadas por madres wild type y viceversa. Los ratones transgénicos alimentados por madres transgénicas presentaron una menor prevalencia de diarrea a los 3, 4 y 7 DPI en relación al control. A los 8 DPI, estos ratones habían resuelto por completo el cuadro clínico. Asimismo, redujeron la infección intestinal por RVA y la excreción viral en heces en comparación con el control. Con respecto a los ensayos de cross-fostering, los resultados obtenidos fueron contradictorios. Si bien los ratones wild type amamantados por madres transgénicas redujeron la prevalencia y duración de la diarrea en relación a los ratones amamantados por madres wild type como se esperaba, presentaron mayores títulos infecciosos en el intestino y una mayor excreción viral fecal. Con el propósito de comparar la eficacia de la administración oral de VHH anti-VP6 con otras opciones terapéuticas disponibles para tratar la diarrea por RVA, se realizó un último experimento en el modelo de ratón lactante infectado con 1778 DD50 de RVA murino para comparar la eficacia de los nanoanticuerpos con dos drogas sintéticas (nitazoxanida, crema de bismuto) y dos hierbas aromáticas usadas tradicionalmente para el tratamiento de la diarrea (Aloysa citrodora, Piper aduncum): 2KD1+3B2 (50 mg/kg) + SRO, 2KD1(50 mg/kg) + SRO, nitazoxanida (15 mg/kg), crema de Bismuto (750 mg/kg), A. citrodora (infusión, 2 g/kg); P. aduncum (infusión, 2 g/kg). En este caso, los VHH fueron disueltos en SRO dado que la adición de este excipiente aumentaba significativamente la resistencia proteolítica frente a enzimas gástricas. A excepción de los ratones tratados con nitazoxanida, los restantes tratamientos redujeron significativamente la duración y la severidad de la diarrea por RVA en relación al control no tratado. En relación a los títulos infecciosos a nivel intestinal, los ratones tratados con VHH anti-VP6, crema de Bismuto y nitazoxanida disminuyeron la severidad de la infección mientras que aquellos tratados con A. citrodora y P. aduncum no mostraron mejoras. La excreción viral en heces sólo se redujo en los ratones tratados con VHH y nitazoxanida pero no se apreciaron diferencias significativas en el resto de los tratamientos. El presente trabajo de tesis muestra que la administración oral de VHH anti-VP6 constituye, no sólo un tratamiento profiláctico efectivo frente a la diarrea asociada a RVA, sino también una herramienta terapéutica eficaz y segura contra la infección por este virus, incluso luego de la aparición de los primeros síntomas. En este sentido, la terapia oral con VHH anti-VP6 representaría un mejoramiento considerable en relación a otras opciones terapéuticas disponibles actualmente. Asimismo, los VHH anti-VP6 podrían ser empleados como una estrategia complementaria a la vacunación, especialmente en poblaciones que han mostrado menor eficacia de inmunización. En términos generales, el uso de anticuerpos VHH dirigidos contra VP6 presenta un enorme potencial para su implementación en pacientes inmunocomprometidos y en países de bajos recursos, donde la mortalidad por RVA continúa siendo elevada y las actuales vacunas muestran menor eficacia.

Species A Rotaviruses (RVA) remain a worldwide leading cause of child mortality. Although extensive vaccination has achieved a significant reduction in RVA-associated deaths, vaccine efficacy in some impoverished areas remains low. On the other hand, mainstay clinical management of RVA-associated diarrhea consists of Oral Rehydration Solution (ORS) administration whereas specific therapeutic options are limited. The main goal of this study was to assess and optimize the use of two VP6-specific llama-derived heavy chain antibody fragments (VHH) -2KD1 and 3B2- in the prevention and treatment of RVA-associated diarrhea and to compare the obtained results with other available therapeutic options against the disease. We first assessed the efficacy of two VP6-specific llama-derived heavy chain antibody fragments (VHH) -2KD1 and 3B2- as an oral prophylactic and therapeutic treatment against RVAinduced diarrhea in a neonatal BALB/c mouse model inoculated with virulent murine RVA (ECw strain, G16P[16]I7). Prophylactic treatment was administered two hours prior to inoculation whereas therapeutic treatment was delivered after viral inoculation, both prior to the symptoms (presymptomatic) and once diarrhea had already occurred (post-symptomatic). In all cases, four-day old pups were inoculated with 1778 DD50 murine RVA at PID 0 (Post Inoculation Day 0) and examined daily to assess occurrence of diarrhea and collect feces. Control and treated mice were euthanized sequentially from PID 0 to 6 for prophylactic groups and from PID 0 to 7 for pre-symptomatic and post-symptomatic therapeutic groups. After sacrifice, sera and intestinal samples were collected. Prophylactic assays: the efficacy of two doses of VHH was assessed, using four litters of suckling mice for each daily treatment: 160 μg of 2KD1+3B2 (N = 31) and 200 μg of 2KD1+3B2 (N = 30). In both cases the treatment started on PID -1 and was administered until PID 6. On PID 0, the VHH were administered 2 hours prior to viral challenge. Controls included: untreated ECw RVAinoculated mice (untreated control group); untreated and not RVA-inoculated mice (normal control group). Pre-symptomatic therapeutic assays: In order to study the therapeutic effect of 2KD1 and 3B2 against RVA-induced diarrhea, treatment administration started at PID 1 and four VHH daily treatments were tested from PID 1 to 7: 160 μg of 2KD1+3B2 (80 μg of each) (N = 25), 200 μg of 2KD1+3B2 (100 μg of each) (N = 28), 200 μg of 3B2 (N = 24), 200 μg of 2KD1 (N = 30). Included controls were the same as before. For both assays, anti-RVA murine antibodies (Abs) were determined in sera and intestinal samples at PID 0, 7 and 40. Occurrence of an immune response against the VHH was examined by measuring anti-VHH Abs titers at PID 0, 7 and 40 in sera and intestinal samples of treated mice and possible uprising of viral escape mutants to the treatment was assessed by PCR, complete sequencing and phylogenetic analyses of VP6. Prophylactic administration of both doses of 2KD1+3B2 successfully reduced diarrhea duration and severity as well as intestinal RVA titers and fecal shedding of viral particles. Joint presymptomatic therapeutic administration of 2KD1+3B2 (200 μg/dose) successfully reduced diarrhea duration, RVA infection severity and virus shedding in feces. While the same dose of 2KD1 or 3B2 (200 μg) significantly reduced duration of RVA-induced diarrhea, 2KD1 was more effective in diminishing the severity of intestinal infection and RVA shedding in feces. Although both clones showed extensive neutralizing properties against a wide range of RVA strains, 2KD1 required lower concentrations than 3B2 to neutralize some of them, particularly the murine RVA strain used in mice assays. Also, 2KD1 evidenced a three-fold higher affinity for RVA particles (EC50) than 3B2. Neither prophylactic nor pre-symptomatic therapeutic administration of the VHH interfered with the host’s humoral immune response against RVA. No viral escape mutants to the VHH treatment were detected. Post-symptomatic therapeutic assays: Mouse pups were also inoculated at PID 0 with 1778 DD50 of murine ECw RVA as described and received a daily dose of 200 μg of 2KD1 from PID 2, at which time all mice in the group had already developed diarrhea, to PID 7. When 2KD1 (200 μg) was administered after diarrhea development, it also significantly reduced RVA intestinal infection and fecal shedding. Although treated mice showed a trend towards reducing diarrhea duration, differences with the control group were not significant. In order to assess the prevention of RVA-induced diarrhea in a model of continuous administration of the VHH, a new assay was conducted, involving transgenic mice that expressed anti-VP6 VHH 2KD1+3B2 in maternal milk regulated under the MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus) promoter. In this case, four-day old mice were inoculated with a lower dose of murine RVA (800 DD50) given that VHH levels in maternal milk were lower than in oral treatment experiments. Four litters of transgenic mice fed by transgenic dams were used and four litters of wild type mice fed by wild type dams were employed as control. In order to discard that the transgenesis per se could have an effect on the development of RVA disease, a cross- fostering assay was conducted. In this case transgenic pups were fed by wild type dams and vice versa. Neonatal transgenic mice fed by transgenic mothers showed lower severe diarrhea prevalence than the wild type control at PID 3, 4 and 7 and by PID 8 all mice in this group had resolved the symptoms completely. Pups nursed by transgenic dams also reduced intestinal infection with RVA and viral shedding in feces when compared with the control. Regarding cross-fostering experiments, the obtained results were inconsistent. Although mice nursed by transgenic dams successfully reduced diarrhea prevalence when compared with mice nursed by wild type dams, as expected, they showed higher intestinal infection and higher fecal shedding. To establish if oral administration of anti-VP6 VHH represents an improvement regarding current clinical management of RVA-associated diarrhea, a last experiment in the neonatal mouse model was conducted to compare the efficacy of the VHH against two synthetic drugs (nitazoxanide, Bismuth salicylate) and two aromatic herbal compounds used in folk medicine for the treatment of diarrhea (Aloysa citrodora, Piper aduncum): 2KD1+3B2 (50 mg/kg) + ORS; 2KD1(50 mg/kg) + ORS, nitazoxanide (15 mg/kg), Bismuth salicylate (750 mg/kg), A. citrodora (infusion, 2 g/kg); P. aduncum (infusion, 2 g/kg). In this case, anti-VP6 VHH were administered with ORS given that the addition increases proteolytic resistance to gastric enzymes. Four-day old mice were inoculated with 1778 DD50 of murine RVA and assessed daily as described before. The obtained results showed that, with the exception of mice treated with nitazoxanide, all other treatments achieved a significant reduction in diarrhea duration and severity when compared with the untreated control. Regarding intestinal RVA titers, mice administered with anti-VP6 VHH, Bismuth salicylate and nitazoxanide diminished the severity of the infection whereas mice treated with aromatic herbs showed no improvement. Similarly, fecal RVA shedding was only significantly reduced in mice receiving VHH and nitazoxanide but not those treated with other compounds. Our findings show that oral administration of anti-VP6 VHH constitute, not only an effective prophylactic treatment against RVA-associated diarrhea, but also a safe and effective therapeutic tool against RVA infection, even once diarrhea is present. These results suggest that oral administration of anti-VP6 VHH represents a significant improvement in the therapeutic treatment of RVA-associated diarrhea when compared with current available options. Anti-VP6 VHH could be used as a complement to ongoing vaccination, especially in populations that have shown lower immunization efficacy. Overall, oral therapy using anti-VP6 VHH has enormous potential to be implemented in developing countries, where RVA mortality is still high and current vaccines seem less efficacious, and also to be administered to prematurely born or immunosuppressed children worldwide.