Brucella abortus: tipificación molecular por MLVA en aislamientos locales, análisis in silico de sus lipoproteínas e implicancia de las lipoproteínas en virulencia

Abstract

La brucelosis es una enfermedad zoonótica de distribución mundial, con un alto impacto en la salud pública y en la economía. De las 10 especies de Brucella reconocidas, B. abortus es la causante de la brucelosis bovina. La publicación del genoma de varias especies de Brucella facilitó el diseño de distintos esquemas basados en marcadores moleculares. El objetivo de la primera parte de la tesis fue emplear un esquema de análisis multilocus de VNTR (Multiple Locus VNTR Analysis, MLVA) en 58 aislamientos de B. abortus de Argentina. El empleo de este esquema de MLVA nos permitió discriminar entre las dos biovariedades de B. abortus analizadas y poner de manifiesto la gran diversidad de genotipos de esta especie circulantes en el país. Además, a través del análisis mediante goeBURST se pudo relacionar a todos los genotipos entre sí y proponer al genotipo de la biovariedad 2, E1, como genotipo fundador. Este hecho ya había sido propuesto por Margaret Meyer en los años 90 basándose únicamente evidencias bioquímicas, en este trabajo se aportan, además, evidencias moleculares. Dada su localización expuesta, las lipoproteínas bacterianas cumplen una gran variedad de funciones, muchas de ellas asociadas a virulencia. En la actualidad, solo tres lipoproteínas de B. abortus, Omp10, Omp16 y Omp19, se encuentran bien caracterizadas. Como primer objetivo de la segunda parte de la tesis, nos propusimos conocer cuántas lipoproteínas están codificadas por el genoma de B. abortus S2308 y qué roles cumplen en la bacteria. Se identificaron 58 lipoproteínas de B. abortus mediante herramientas bioinformáticas. Para determinar su rol en virulencia, se generaron cepas mutantes mediante disrupción integrativa de los genes que codifican para 24 de ellas y posteriormente, se evaluó si presentan fenotipo atenuado en el modelo murino de infección esplénica. Una de las mutantes resultó atenuada (B. abortus Lp1, siendo BAB1_0009 el marco de lectura interrumpido) por lo que se realizaron diferentes estudios para caracterizarla. Posteriormente, se analizó la capacidad de generar una respuesta inmune protectora de la cepa mutante atenuada empleando el modelo de protección esplénica en ratones BALB/c. Los resultados mostraron una capacidad protectiva superior a la generada por la cepa B. abortus S19, empleada como cepa vacunal en la actualidad en bovinos. Para determinar si la 3 atenuación en virulencia de la mutante en B. abortus también se observa al interrumpir los genes ortólogos de B. suis y B. melitensis, se construyeron las respectivas cepas mutantes, se evaluó su virulencia y se caracterizaron. Se confirmó el fenotipo atenuado sólo en la cepa mutante de B. suis. Esta parte de la tesis contribuyó a determinar los posibles roles que cumplirían las lipoproteínas en B. abortus y a identificar a una lipoproteína, OppA, codificada por BAB1_0009, que participaría en virulencia en B. abortus y B. suis y que, al menos la cepa mutante B. abortus Lp1, sería capaz de generar una respuesta inmune protectora en el modelo murino. Estos resultados sientan las bases para el diseño y evaluación de nuevas vacunas contra la brucelosis.

Brucellosis is a zoonotic disease, worldwide spread, which remains an important problem due to economic loss and public health concern. Of the ten species described, B. abortus is the causative agent of bovine brucellosis. Publication of microorganism genomes facilitates the design of molecular markers. The aim of the first part of the thesis was to employ Multiple Locus VNTR Analysis (MLVA) scheme for strains from Argentina isolated in our laboratory. This scheme allowed differentiating each isolate to B. abortus biovar 1 or biovar 2 and to show a wide diversity among the genotypes present in our country. Also, through goeBURST analysis all the genotypes were related and the genotype of biovar 2, E1, was proposed as founder genotype. This fact have been previously proposed by Margaret Meyer based only in biochemical evidence. Our work, also, provides molecular evidence in this sense. Since lipoproteins are surface exposed, they accomplish a wide variety of roles, some of them related with virulence. Currently, only three lipoproteins of B. abortus, Omp10, Omp16 and Omp19, are well characterized. Our aim was to know how many lipoproteins are encoded by B. abortus S2308 genome and what their roles in the bacterium are. A total of 58 lipoproteins were identified by bioinformatic tools. To determine whether lipoproteins participate in functions related with virulence, 24 mutant strains were generated by integrative disruption of the genes that codes to the lipoproteins. Then, it was evaluated if they are attenuated in the murine model of spleenic infection. One of them was attenuated (B. abortus Lp1, being BAB1_0009 the ORF interrupted) and therefore it was characterized. Also, the ability to induce a protective immune response was analyzed through the spleenic protection model in BALB/c mice. The results show that the protection induced by B. abortus Lp1 was greater than the protection induced by B. abortus S19, which is the strain used as vaccine in bovine. In order to determine whether attenuation in virulence is also observed when the ortholog genes are interrupted in B. suis and B. melitensis, the corresponding mutant strains were constructed and characterized. Virulence of the mutant strains was evaluated. An attenuated phenotype was observed only in B. suis mutant strain. This part of the thesis contribute to determine the putative roles of lipoproteins in B. abortus and to identify a lipoprotein, OppA, enconded by BAB1_0009 that would be involved in virulence in B. abortus and B. suis. And, at least in B. abortus S2308, it would induce a protective immune response in the murine model. These results establish the basis for the development of new vaccines against brucellosis.