Factores de virulencia de Bacilus thuringiensis y su utilización para el control de coleópteros de alto impacto en el sector agropecuario

Abstract

La necesidad de contar con herramientas seguras y efectivas para el manejo de plagas, alternativas o complementarias a los insecticidas químicos, estimula el interés en usar entomopatógenos como agentes de biocontrol. Bacillus thuringiensis es entre ellos, el patógeno más exitoso en cumplir este objetivo, y el que además mantiene potencial para seguir desarrollándose. En este estudio se trabajó en la selección y caracterización de cepas de B. thuringiensis tóxicas para larvas de dos especies de coleópteros plagas que son de gran importancia en el Sector Agropecuario: el picudo del algodonero (Anthonomus grandis) y el escarabajo de la cama de pollos (Alphitobius diaperinus). Asimismo, se trabajó en el mejoramiento de un medio de cultivo para obtener una mayor biomasa activa de una cepa nativa de B. thuringiensis con vistas a la elaboración de un bioinsecticida. En una primera etapa, se realizaron bioensayos preliminares con cultivos completos de 124 cepas de B. thuringiensis con larvas neonatas de A. grandis. Se seleccionaron tres cepas exóticas y cuatro nativas por causar porcentajes de mortalidad superiores al 50%. Todas ellas eran productoras de ?-exotoxina. Las cepas nativas compartieron una morfología similar de cristales parasporales, un perfil de proteínas similar y los mismos genes insecticidas. Sus características hacen que se parezcan a cepas tóxicas para Lepidópteros. Además mostraron un perfil de REP-PCR idéntico al de la cepa lepidoptericida HD-1, sugiriendo que podrían pertenecer al serovar kurstaki. Sin embargo, se observaron diferencias en el perfil plasmídico y en la producción de ?-exotoxina. Para determinar en qué fracción del cultivo se encontraban los metabolitos responsables de la toxicidad, se realizaron bioensayos utilizando pellets resuspendidos y sobrenadantes filtrados, comparándolos con los cultivos completos. Ambas fracciones mostraron diferentes niveles de toxicidad. Los resultados sugieren que los principales factores de virulencia se encuentran en el sobrenadante y estarían directamente relacionados con la presencia de ?-exotoxina. De acuerdo con los bioensayos de los sobrenadantes filtrados y sobrenadantes filtrados y autoclavados, no se descartaría también la participación de factores de virulencia termolábiles como Cry1Ia en la toxicidad. En las cepas seleccionadas el principal factor de virulencia sería la ?-exotoxina, por lo que su uso no sería posible de acuerdo a la reglamentación vigente. No obstante, estas podrían ser fuente de genes (ej: cry1Ia) para la producción de plantas transgénicas resistentes a dicha plaga. En una segunda etapa, se realizaron bioensayos preliminares con cultivos completos de 42 cepas de B. thuringiensis con larvas de 2º estadio de A. diaperinus. Las cepas evaluadas no resultaron tóxicas o presentaron porcentajes de mortalidad menores al 10%, exceptuando la cepa nativa INTA Mo4-4 y B. thuringiensis svar. morrisoni cepa tenebrionis DSM2803. Ninguna de estas dos cepas demostró producir ?-exotoxina, sugiriendo que este metabolito no tendría un papel preponderante en la patogenicidad. Ambas cepas presentaron morfología similar de cristales, un perfil de proteínas similar y los mismos genes insecticidas. Sin embargo, alguna diferencia surgió cuando se compararon los perfiles electroforéticos de REP-PCR. Ambas cepas mostraron perfiles similares que difieren por la presencia de una banda polimórfica en INTA Mo4-4. Estas similitudes sugieren que esta cepa podría representar una variante dentro del serovar morrisoni. Al igual que para A. grandis, se analizó en qué fracción del cultivo se encontraban los metabolitos responsables de la toxicidad. Los resultados mostraron que los metabolitos tóxicos principales se encontrarían en el pellet y se asociarían a proteínas Cry3. Se cuantificó la virulencia del pellet seco y molido de ambas cepas para la estimación de la concentración letal media y de otros parámetros estadísticos empleando bioensayos ?finos?. La cepa INTA Mo4-4 resultó significativamente más tóxica que la cepa tenebrionis DSM2803. Se observó además que la solubilización y tripsinización in vitro de los cristales de INTA Mo4-4 no influyen significativamente sobre su virulencia. Por lo expuesto, la cepa nativa INTA Mo4-4 se constituyó como la mejor opción para ser utilizada como ingrediente activo de un formulado nuevo destinado al manejo de A. diaperinus. Teniendo en cuenta esta premisa, se seleccionó el caldo BM con almidón soluble como medio propicio para la producción de INTA Mo4-4, debido a que fue en él donde se logró una mayor producción de proteínas totales. Posteriormente, se empleó un diseño de Plackett-Burman para determinar cuáles de los ocho componentes del caldo mencionado afectaban significativamente la producción de proteínas de la biomasa activa. Se obtuvo de ese estudio que el extracto de levadura es un componente importante del caldo BM, que influyó significativamente y positivamente en la producción de proteínas. La glucosa y el almidón (fuentes de C) demostraron respectivamente, un efecto negativo y positivo, aunque no significativo, sobre la producción de proteínas. Sabiendo que las proporciones de C:N en los medios de cultivo son importantes para el crecimiento normal de B. thuringiensis y la producción de proteínas Cry, y considerando que el análisis de Plackett-Burman sólo detecta efectos principales sin tener en cuenta interacciones, resultó de interés avanzar en el estudio de la interacción entre el extracto de levadura y el almidón soluble. Los dos componentes seleccionados fueron optimizados utilizando un diseño central compuesto rotatorio. Se logró mejorar el caldo BM con la información generada. Se obtuvo una producción de proteínas insecticidas de INTA Mo4-4 significativamente mayor respecto al medio original, lo que se tradujo en un aumento significativo de la toxicidad para A. diaperinus.