Estudio de la interacción hospedante-patógeno entre plantas y el virus de Mal de Río Cuarto (MRCV)

Abstract

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la principal enfermedad del maíz en nuestro país provocando grandes pérdidas económicas. El virus es transmitido por chicharritas de la familia Delphacidae e infecta además diversas gramíneas como trigo, cebada, avena y sorgo, dando lugar a síntomas severos. El genoma del MRCV está formado por diez segmentos de ARN doble cadena (ARNdc) que codifican para trece proteínas. Durante el ciclo de infección, el MRCV replica en cuerpos de inclusión citoplasmáticos virales denominados viroplasmas, y nuestro grupo demostró que están compuestos principalmente por la proteína no estructural P9-1 (Maroniche, 2011). Para otros reovirus se ha demostrado que los viroplasmas contienen además ARN viral y proteínas virales minoritarias junto con componentes celulares del hospedante. Con el fin de avanzar en la comprensión de las bases moleculares de la enfermedad en primer lugar se analizaron las interacciones de las proteínas del MRCV entre sí utilizando la técnica de doble híbrido de levaduras (Y2H). Se identificaron cuatro interacciones positivas: P6 con P6 y con P9-1, P9-1 con P9-1, y P9-2 con P9-2. Se definieron además las regiones de P6 y de P9-1 involucradas en las interacciones utilizando mutantes de deleción y se encontró que la región central de P6 con un posible dominio “coiled-coil” es necesaria para la interacción consigo misma y con P9-1, mientras que los últimos 24 residuos de P9-1 intervienen en la formación de dímeros de P9-1. Estos resultados, junto con resultados previos del grupo (Maroniche, 2011), permitieron postular a P6 como componente minoritario del viroplasma e indicaron que la región C-terminal de P9-1 sería necesaria para la formación del viroplasmas. Adicionalmente se evaluó la interacción de las proteínas virales P6, P7-2, P9-1, P9-2 y P10 con proteínas celulares que son candidatas a cumplir roles relevantes en la interacción MRCV hospedante. Ente otros resultados, se encontró que P7-2 interactúa con la proteína SKP1 (S Phase Kinase Associated Protein 1) componente del complejo E3 ligasa del sistema ubiquitina proteasoma (UPS). Estos resultados son de gran relevancia ya que sugieren que P7-2 tiene la capacidad de interferir con el UPS. Para continuar con la caracterización de las proteínas virales P9-1 y P6 e identificar posibles componentes celulares asociados con los viroplasmas, se realizaron relevamientos de una biblioteca de ADN copia (ADNc) de hoja de trigo por Y2H. Se encontró que P9-1 es capaz de interactuar con una proteína con posible función de aldosa 1-epimerasa y otra con posible función de aciltransferasa. Por su parte, P6 mostró interacción con una posible tiorredoxina. Dado que las proteínas identificadas intervienen en el metabolismo de la planta, se postula que su interacción con proteínas virales podría estar asociada con la generación de síntomas. Finalmente se determinó que tanto P6 como P9-1 contienen potenciales motivos PEST de degradación vía proteasoma. Se construyeron mutantes sin estos motivos y se observó un incremento en los niveles de acumulación de P6 y P9-1 mutadas en plantas, sugiriendo que los PEST serían funcionales. Si bien aún resta comprender los mecanismos precisos que subyacen a las interacciones proteína-proteína encontradas en este trabajo de Tesis y sus consecuencias biológicas, estos resultados significan un importante avance en el conocimiento de la función y rol de las proteínas codificadas por el MRCV, en especial de P6 y P9-1.

Mal de Río Cuarto virus (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causes the most important maize disease in Argentina leading to great economic losses. The virus is transmitted by planthoppers from the Delphacidae family and also infects other grasses like wheat, rye, oat and sorghum, causing severe symptoms. The MRCV genome is composed of ten double stranded RNA (dsRNA) segments that code for thirteen proteins. During its infection cycle, MRCV replicates incytoplasmic inclusion bodies called viroplasms, and our group has found that are mainly composed by the viral non-structural protein P9-1 (Maroniche, 2011). In other reovirus, the viroplasms also contain viral RNA and minor viral proteins as well as cellular components of the host. To gain insight into the molecular basis of the disease, MRCV protein-protein interactions were analyzed using the yeast two-hybrid (Y2H) technique. Four positive interactions were found: P6 with itself and with P9-1, P9-1 with P9-1, and P9-2 with P9-2. The regions of P6 and P9-1 involved in such interactions were also identified by using deletion mutants. Through these analyses, it was established that the central region of P6 containing a possible coiled-coil domain is necessary for P6/P6 and P6/P9-1 interactions, whereas the last 24 residues of P9-1 are involved in P9-1 dimmer formation. These results, together with previous results of our group (Maroniche, 2011), allowed us to postulate P6 as a minor viroplasm component and they also suggest that P9-1 C-terminal region is necessary for viroplasm assembly. Additionally, the interactions of viral proteins P6, P7-2, P9-1, P9-2 and P10 with cellular proteins that are proposed to have important roles in MRCV-host interaction were analyzed. Among other results, it was found that P7-2 interacts with SKP1 (S-Phase Kinase Associated Protein 1), component of E3 ligase complex of the ubiquitin-proteasome system (UPS). These results are relevant because they suggest that P7-2 is able to interfere with the UPS. To further characterize P6 and P9-1 and to identify possible cellular components of the viroplasms, Y2H screenings of a wheat copy DNA (cDNA) library where carried out. These assays showed that P9-1 interacts with a putative aldose 1-epimerase and with a putative acyltransferase. In addition, P6 interacts with a protein with a predicted thiorredoxin activity. Given that the identified proteins are involved in the plant metabolism, their interaction with viral proteins might be associated with symptom development. Finally, it was identified that P6 and P9-1 contain potential PEST motives for degradation through the UPS. P6 and P9-1 mutants without these motives showed increased protein accumulation in plants, suggesting that their PEST motives are functional. Although the mechanisms underlying the protein-protein interactions found in this Thesis, as well as their biological consequences remain unknown, this study broadens the current knowledge of the function and role of MRCV encoded proteins, in particular those of P6 and P9-1.