Cancro del tallo de soja por Diaporthe caulivora: aportes para la detección de la resistencia a la penetración e invasión y de infecciones latentes

Abstract

El tipo de cancro del tallo de la soja prevalente en Argentina es el causado por Diaporthe caulivora (Dc), pudiendo causarle serias pérdidas al cultivo. La infección ocurre en estadíos vegetativos tempranos y los síntomas aparecen 50-60 días después, aunque Dc puede permanecer asintomático en infecciones latentes (IL). El uso de cultivares resistentes es una forma de manejo fitosanitario eficiente. La resistencia ante Dc en soja se evalúa generalmente con métodos de inoculación con heridas y micelio (MIC), siendo el más usado el del palillo (PAL). Su agresividad no parece representar la infección natural y alteraría la respuesta de las plantas. El manejo sanitario se complica por el uso de genotipos susceptibles y la ocurrencia de IL en este patosistema. La comparación de los métodos de inoculación PAL, MIC y su variante MICa (micelio, sin herida) y ASC (ascosporas, sin herida) se realizó con Dc (wt-Dc) en tres experimentos en ambiente semicontrolado con plantas de DM3810RR, SPS3x5RR y A054 en estadios V1–V3. Variables cuantitativas y categóricas fueron registradas desde los 6 a 60 días después de inocular (ddi). Para caracterizar las infecciones se ajustó un protocolo de transformación con Agrobacterium tumefaciens para obtener un aislado transgénico de wt-Dc con el gen de la proteína verde fluorescente (GFP). Plantas de DM3810RR y SPS3x5RR fueron inoculadas con los métodos MICa y PAL y los aislados original y transgénico. En 20 muestreos secuenciales las plantas fueron evaluadas por síntomas externos, seccionadas y observadas con microscopía de campo claro (azul de anilina 0,1 % para controles y wt-Dc) y fluorescencia para seguir la invasión y colonización del patógeno en el tallo desde 12 h después de inocular (hdi) hasta 152 ddi. El método PAL fue el único que diferenció significativamente los genotipos probados. La severidad de síntomas e incidencia aparente fueron bajas y crecientes en ASC, MIC y MICa. Se registraron IL en todos los métodos de inoculación, con mayor frecuencia en MIC y MICa. La incidencia aparente, marchitez y lesión externa medible tuvieron siempre el valor más elevado en el método PAL seguido por MICa, MIC y ASC. Se obtuvieron por primera vez aislados de wt-Dc portadores de la GFP. La inserción del ADN-T en el ADN del patógeno causó fenotipos similares a wt-Dc y mutantes. La infeccion por los dos aislados ocurrió 24 hdi en ambos cultivares y métodos. Los síntomas aparecieron 48 hdi. Se observaron hifas asociadas a tricomas desde 12 hdi hasta 75 ddi. En pocas horas el patógeno alcanzó inter y luego intracelularmente, el parénquima cortical, floema, xilema y el parénquima medular. Este patrón fue similar en ambos cultivares. La severidad de síntomas fue signifcativamente mayor en plantas inoculadas con herida (MIC o PAL) y en DM3810RR comparado con SPS3x5RR. El porcentaje de IL en los cultivares no varió significativamente en el método MICa. Las IL ocurrieron hasta los estadíos R5 (SPS3x5RR) y V8 (DM3810RR). No fue posible predecir las IL en los cultivares probados. El método sin herida MICa sería una alternativa viable para mejorar la manifestación del comportamiento de los genotipos ante Dc.

Soybean stem canker caused by Diaporthe caulivora (Dc) is the prevalent type of canker in Argentina, and can cause serious crop loss. The infection occurs in early vegetative stages and symptoms appear 50-60 days later, although Dc can persist asymptomatically in latent infections (LI). The use of resistant cultivars is one of the most efficient disease management practices. Resistance to Dc in soybean is generally evaluated using wounding inoculation methods with mycelium, being the toothpick method (TPK) the most used. Its aggressiveness would not represent natural infections and would alter the plant's response. Disease management is complicated by the use of susceptible genotypes and the occurrence of IL in the soybean-Dc pathosystem. To compare inoculation methods with Dc (wt-Dc), plants of cultivars DM3810, SPS3x5 and A054 in V1–V3 stages were inoculated in a semi-controlled environment in three experiments using of the methods TPK, MYC and its variant MYCa (mycelium, without wound) and ASC (ascospores, without wound). Quantitative and categorical variables were recorded 6 to 60 days after inoculation (dai). To characterize infections in soybean plants, an Agrobacterium mediated transformation protocol was adjusted to obtain a transgenic isolate from wt-Dc carrying the green fluorescent protein (GFP) gene. DM3810 and SPS3x5 plants were inoculated with the MYCa and TPK methods using the transgenic and wt-Dc isolates. In 20 sequential samplings the plants were evaluated for external symptoms, sectioned and observed with bright field microscopy (0,1 % aniline blue staining for control and wt-Dc-inoculated plants) and fluorescence microscopy to follow the invasion and colonization in the stem from 12 h after inoculation (hai) until 152 dai. The TPK method was the only one that detected significant differences among the tested genotypes. Symptom severity and apparent incidence were low and increasing in ASC, MYC and MYCa. LIs occurred in all inoculation methods, most frequently in MYC and MYCa. Apparent incidence, wilting and measurable lesion lenght always had the highest value in the TPK method, followed by MYCa, MYC, and ASC. Isolates of wt-Dc carrying the GFP were obtained for the first time. Insertion of T-DNA into genomic DNA caused phenotypes similar to wt-Dc and also mutants. Infection by the two isolates occurred 24 hdi in both cultivars and methods. Symptoms appeared 48 hai. Hyphae associated with trichomes were observed from 12 hai to 75 ddi. In a few hours the pathogen reached first inter and then intracellularly, the cortical parenchyma, phloem, xylem and the stem pith. This pattern was similar in both cultivars. Symptom severity was signifcantly greater in wound-inoculated plants, and in DM3810RR, compared to non-wounded and SPS3x5RR, respectively. IL were detected in both genotypes, although proportions were not statistically different in the MICa method. ILs occurred up to stages R5 (SPS3x5RR) and V8 (DM3810RR). It was not possible to predict the ILs in the tested cultivars. The MICa wound-free method would be a viable alternative to improve the manifestation of genotypic behavior against Dc.