Métodos matemáticos y modelos estadísticos aplicados a la estimación de la curva de dosis-respuesta en un estudio de exposición oral de cerdos gnotobióticos a Norovirus humano

Abstract

Los modelos animales son utilizados en estudios pre-clínicos para reproducir las infecciones por patógenos humanos. En el proceso de estandarización de estos modelos resulta indispensable conocer cómo se producen la infección y enfermedad a medida que aumenta la dosis del patógeno. Los modelos dosis-respuesta son funciones matemáticas que permiten describir la relación entre la dosis de un patógeno y la severidad de la infección y enfermedad que genera en un hospedador dado. Los métodos aplicados a la estimación de los parámetros de estas curvas se han desarrollado desde hace varios decenios. Inicialmente se empleaban métodos de interpolación matemática, como el método de Reed-Muench y el método de Dragstedt-Beherens, que permiten estimar la dosis de una suspensión viral dada que causa infección o enfermedad en la mitad de los individuos desafiados y denominada dosis efectiva 50%. Si bien estos métodos siguen utilizándose en la actualidad, carecen de base estadística. Más tarde, se desarrolló el método no paramétrico de Spearman-Karber, que es el que se emplea actualmente a nivel de las agencias regulatorias. Con el advenimiento de nuevas herramientas estadísticas y la capacidad computacional surgieron los modelos lineales generalizados o GLM (por ejemplo, el modelo de la regresión logística). Estos modelos permiten realizar inferencia sobre estadísticos importantes como la dosis efectiva 50% teniendo en cuenta su variabilidad e incertidumbre. Recientemente, y partir de un conocimiento más cabal de la biología detrás de una infección y el desarrollo posterior de una enfermedad, se han desarrollado modelos con base mecanicista. Estos últimos modelos resultan muy valiosos para el estudio de análisis de riesgo asociado a la contaminación de agua y alimentos con agentes virales, como, por ejemplo, Norovirus humano. El presente trabajo de tesis de maestría se propuso emplear los métodos de interpolación matemática clásicos de Reed-Muench y Dragstedt-Beheren, el método no paramétrico de Spearman-Kaber, un modelo lineal generalizado, la regresión logística, y los modelos de regresión no lineal log-logístico y mecanicistas Exponencial y Beta-Poisson para estimar la dosis de infección (DI50%) y enfermedad (DD50%) 50% en un ensayo de dosis-respuesta en cerdos gnotobióticos desafiados con una cepa de Norovirus humano. Todos estos modelos utilizan la condición infectado/no infectado o enferno/sano o bien la proporción de individuos afectados dentro del grupo que recibió la misma dosis como variable respuesta. Como alternativa novedosa, la tesis exploró también la estimación de la DI50% y DD50% ajustando una regresión log-logística sobre el área de la curva de excreción viral y score fecal, dos variables continuas que reflejan la severidad de la infección y del cuadro clínico de diarrea. Los parámetros de los diferentes modelos estadísticos se estimaron por máxima verosimilitud y su incertidumbre se evaluó mediante la estimación de intervalos de confianza aplicando diferentes métodos. La bondad de ajuste y performance relativa de cada modelo se evaluó mediante el criterio de información de Akaike. Los resultados obtenidos de aplicar los diferentes modelos a los datos de proporciones de animales infectados y enfermos indicaron que la DI50% se encontró alrededor de las 2500 copias de genoma viral y la DD50% alrededor de las 21000 copias. Independientemente del método empleado, las estimaciones obtenidas arrojaron valores similares. Los modelos mecanicistas Exponencial y Beta-Poisson fueron los que mejor ajustaron los datos de infección. Por su parte, para los datos de enfermedad fue el modelo Beta-Poisson el que arrojó el mejor ajuste. Llamativamente, el ajuste del modelo de regresión log-logístico sobre las variables continuas de área bajo la curva de excreción viral y severidad del cuadro clínico arrojó valores para la DI50% y la DD50% que sen encuentran en el mismo orden que los calculados en base a los datos discretos, lo que sugiere que este enfoque también podría comenzar a considerarse para estimar las dosis infecciosas y enfermedad 50% para un patógeno viral. Los métodos contemporáneos ofrecen mayor precisión y exactitud que los métodos clásicos para estimar las dosis efectivas 50%. A su vez, permiten el análisis de datos generados utilizando diluciones no equidistantes y con un número desbalanceado de unidades experimentales entre dosis. La dosis de desafío de la cepa de NoV humano Genogrupo II.2, Cin-2, evaluada en este estudio quedó establecida en 2 x 105 copias de genoma viral, la cual logra reproducir en cerdos gnotobióticos los tiempos de incubación, duración y severidad de la infección y diarrea por NoV que ocurren en voluntarios humanos experimentalmente desafiados con cepas del genogrupo I y II. Estimaciones precisas de los parámetros de infección y enfermedad bajo análisis estadísticos robustos contribuyen a la correcta estandarización del cerdo gnotobiótico como un modelo animal adecuado para estudios pre-clínicos de pruebas de vacunas y otras estrategias antivirales contra Norovirus humanos.

In the process of standardizing animal models in pre-clinical studies, which reproduce infections by human pathogens, it is essential to know how infection and disease occur as the dose of the pathogen increases so that the animal model represents as precisely as possible what happens in humans. Dose-response models are mathematical functions that allow describing the relationship between the dose of a pathogen and the severity of the infection and disease it generates in a given host. The methods applied to the estimation of the parameters of these curves have been developed for several decades. Initially, mathematicalinterpolation methods were used, such as the Reed-Muench and the Dragstedt-Beherens methods, which allow estimating the 50% effective dose of a given viral suspension, which represents the viral dose that causes infection or disease in the half of the individuals challenged. Although these methods are still in use today, they lack statistical foundation. Later, the nonparametric Spearman-Karber method was developed, which is the one currently used at the level of regulatory agencies. Recently, with the advent of new statistical tools and computational capacity, generalized lineal models, GLM, emerged including the parametric models such as logistic regression, which possess a sigmoideal shape and allowed a better fit and inference to the dose responde data. From a more thorough understanding of the biology behind an infection and the subsequent development of a disease, within GLMs the mechanistically based models like the Exponential and the Beta Poisson regresions have been developed. Under the fulfillment of certain biological assumptions, mechanistic models allow modeling the dose-response relationship with great precision and making statistical inferences considering, at the same time, its variability and uncertainty. These last models are very valuable for the study of risk analysis associated with the contamination of water and food with viral agents, such as, for example, human Norovirus. In the same line of study of dose response trials, sigmoid regressions can also be applied on both discrete binary variables and continuous variables. The latter approach is widely used in pharmacology and toxicology but has not been applied in virology for the 50% dose calculation.The present Master's thesis work proposes to use the classic mathematical interpolation methods of Reed-Muench and Dragstedt-Beheren, the non-parametric method of Spearman-Kaber, logistic regression and the Exponential and Beta-Poisson mechanistic models to estimate the dose of infection (ID50%) and disease 50% (DD50%) from discontinuous, dichotomous or binary variables such as the proportion of infected and diseased animals obtained in a dose-response test in gnotobiotic pigs challenged with a strain of human norovirus. The thesis also explores the dose response effect and the estimation of the ID50% and DD50% using sigmoid models as the two parameter log-logistic distribution from the binary variable mentioned above and also a three parameter log-logistic distribution applied on the continuous variables corresponding to the area of the viral excretion curve and fecal score, which reflect the severity of the infection and the clinical picture of diarrhea. The parameters of the different statistical models were estimated by the maximum likelihood method and their uncertainty was evaluated by the estimation of confindence intervales using different calculations (Delta method, Bootstrap simulation method, etc). The goodness of fit and relative performance of each model was evaluated using the Akaike information criterion (AIC). The results obtained from applying the different models to the data of proportions of infected and diseased animals indicate that the ID50% is around 2500 genome of viral genomes, and the DD50% around 21000 copies. All the results obtained from these dichotomous variables yielded similar values regardless of their methodological basis. Of the mechanistic methods, both the Exponential distribution and the Poisson beta were optimal to fit the infection data. However, for the disease data, the Poisson beta distribution was the one that yielded the best fit. Interestingly, the adjustment of a 3P L.L. model on the continuous variables AUC of virus shedding and AUC of diarrhea score yielded logDI50% = 3.85. and logDD50%=4.46 which are in the same order as those calculated based on the binary data of proportions of infected and diseased animals, which suggests that this approach could also begin to be considered to estimate the infectious doses and disease 50% for a viral pathogen. Contemporary methods offer greater precision and accuracy in estimating 50% effective doses than classical methods. In turn, they allow the analysis of data generated using non-equidistant dilutions and with an unbalanced number of experimental units between doses. The challenge dose of the human NoV Genogroup II.2, Cin- 2 strain, evaluated in this study was established at 2 x 105 copies of viral genome, which manages to reproduce in gnotobiotic pigs the incubation times, duration and severity of infection and diarrhea by NoV that occur in human volunteers experimentally challenged with NoV group I and II. Precise estimates of the infection and disease parameters under robust statistical analysis contribute to the correct standardization of the gnotobiotic pig as a suitable animal model for pre-clinical studies of human NoV.