Estudio de Potyvirus y Nigrospora oryzae como agentes patógenos del género Calibrachoa

Abstract

El germoplasma proveniente de especies nativas es una importante fuente de variabilidad para la obtención de nuevos productos o la resolución de problemas sanitarios y agronómicos en los sistemas productivos de plantas ornamentales. Dado que los recursos genéticos son pilares estratégicos para el desarrollo productivo, la Argentina se encuentra en un lugar clave debido a su riqueza biológica y a su historia en el intercambio de fitogermoplasma con otras naciones. En este sentido, el Instituto de Floricultura, perteneciente al Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) lleva a cabo diversos proyectos relacionados con el acceso y el uso sustentable de los recursos fitogenéticos nativos del país con fines de investigación y productivos. Dentro de estas actividades, y desde 2002, dicho Instituto realiza el mejoramiento del género Calibrachoa (plantas conocidas vulgarmente como calibrachoas) con la finalidad de obtener variedades ornamentales para el mercado nacional e internacional. Actualmente, se encuentran registradas tres variedades denominadas Pampa Salmón INTA, Overá Fucsia INTA y Garden Rose. Calibrachoa se encuentra entre los géneros de mayor importancia en la comercialización de plantines florales a nivel mundial y, según datos que surgen de entrevistas a referentes de la empresa Sakata Seed, los Estados Unidos importan y demandan alrededor de 230 millones de esquejes de Calibrachoa hybrida por año, lo cual representa un ingreso potencial de 40 millones de dólares anuales.Calibrachoa es un género que pertenece a la familia Solanaceae Adans, subfamilia Cestroideae Schltdl., tribu Nicotianae G. Don. y está constituido por 28 especies. En la Argentina habitan 12 especies nativas cuyo centro de distribución es la Región Mesopotamia. Se caracteriza por poseer crecimiento vigoroso y flores de corola infundibuliforme de diferentes tamaños y colores tales como rosa, violeta, fucsia, rojo, amarillo y salmón. En relación con los aspectos agronómicos, la infección por patógenos es uno de los factores de mayor importancia que limitan la producción de Calibrachoa. Con respecto a las enfermedades virales, en los Estados Unidos se ha reportado que este género es afectado por Calibrachoa mottle virus, especie incluida dentro del género Carmovirus y en Israel por Tobacco mild green mosaic virus, del género Tobamovirus. En la Argentina, desde 2009, en el Instituto de Floricultura INTA se realizan detecciones de virosis de cultivos ornamentales mediante la técnica ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) en sus diferentes variantes. Desde ese año hasta la actualidad no se registraron casos de Groundnut ringspot virus ni Tomato chlorotic spot virus en Calibrachoa. Solamente en 2012 se detectaron dos plantas con Calibrachoa mottle virus (1,8 % de incidencia) y en 2010 y 2011, se observó 8 y 3 % de incidencia de Cucumber mosaic 4 virus, respectivamente. A su vez, se encontraron valores similares de incidencia de Tomato spotted wilt virus durante esos dos años. En cambio, durante todos los años de análisis se detectó la presencia del grupo Potyvirus con mayores porcentajes de incidencia, por lo que resultó necesaria la profundización de los estudios relacionados con la identificación de los potyvirus patógenos de Calibrachoa hybrida. Esto permitió detectar, mediante RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa) y posterior secuenciación, que la especie viral presente en estas plantas era Potato virus Y (PVY). Con respecto a las estrategias de manejo de las enfermedades de calibrachoa, fue fundamental analizar el rol de las semillas en la transmisión de PVY y la evaluación de la influencia de los factores ambientales sobre este proceso. Por ello, se realizaron cruzamientos dirigidos entre plantas infectadas con PVY, y entre plantas infectadas con PVY y plantas sin infectar, durante el verano, el otoño y la primavera. A partir de la técnica RT-PCR, se confirmó que esta especie viral se transmite por semillas tanto en el caso de uno como de ambos padres infectados, independientemente de las condiciones de temperatura ambiente y época del año, y que existe una incidencia importante del tejido materno sobre la cantidad de semillas producidas y la cantidad de plantas logradas a partir de los cruzamientos. Además, se llevó a cabo la identificación de genotipos resistentes a patógenos, cuyo conocimiento permite incorporar fuentes de variabilidad a los programas de mejoramiento, evitando problemas sanitarios. Las variedades resistentes representan una estrategia simple, segura y efectiva para limitar las pérdidas ocasionadas por enfermedades y, a su vez, impiden su diseminación hacia otros cultivos de la zona que también puedan ser sus hospedantes. Para ello, se llevó a cabo la inoculación (por transmisión mecánica) de plantas silvestres de Calibrachoa y de Petunia provenientes del banco de germoplasma del Instituto de floricultura (Calibrachoa caesia, C. thymifolia, C. linoides, Petunia inflata y P. integrifolia) con un extracto proveniente de plantas de Calibrachoa fehacientemente infectadas con PVY. Posteriormente, mediante observación de la sintomatología y detección mediante ELISA y RT-PCR, se vio que todas las plantas analizadas se infectaron con el virus, lo que mostró la ausencia de resistencia en estas plantas a PVY. Por otro lado, la producción de plantas con sanidad controlada constituye otra forma eficaz de reducir el efecto perjudicial de las enfermedades, pero para ello se requiere el desarrollo de métodos de eliminación de patógenos. La regeneración de plantas in vitro a partir del cultivo de meristemas o de ápices caulinares es la técnica utilizada con mayor frecuencia para la liberación de virus, por lo que en este trabajo se llevó a cabo la optimización de un protocolo de regeneración de plantas de Calibrachoa cv. Pampa 5 Salmón INTA a partir de meristemas apicales, mediante el análisis comparativo de diferentes medios de cultivo. Finalmente, se vio que la combinación de MS ½ (Murashige y Skoog ½) + 0,01 mg L-1 6-bencilaminopurina (BAP) resultó en la obtención de un alto porcentaje de regeneración de plantas completas, además de una mayor producción aérea y radical que, consecuentemente, permitieron una alta tasa de sobrevivencia de plantas luego de su transferencia al invernáculo. A partir de este avance, se pudo realizar el cultivo de meristemas con el objetivo de sanear las plantas de C. cv. Pampa Salmón INTA infectadas con PVY y, concluyendo que esta técnica permitió erradicar el PVY en el 74% de los casos, confirmado mediante RT-PCR. En cuanto a las enfermedades causadas por hongos y organismos afines sobre C. hybrida, a nivel mundial se ha informado la presencia de los Oomycetes Phytophthora nicotianae, P. infestans, P. capsici y P. tropicalis, y de hongos como Thielaviopsis basicola, mientras que en la producción nacional las variedades de Calibrachoa también se han mostrado susceptibles a infecciones por Fusarium sp., Alternaria spp. y Nigrospora oryzae. En plantas de Calibrachoa producidas en el Instituto de Floricultura e infectadas con potyvirus, se ha observado el desarrollo de manchas foliares ocasionadas por Nigrospora oryzae, por lo que resultó necesario analizar el patosistema de una forma integrada a partir del estudio de la interacción patógenos-hospedante. Para ello, plantas de C. cv. Pampa Salmón INTA infectadas con PVY y plantas de C. cv. Pampa Salmón INTA sin infectar fueron inoculadas con N. oryzae. No se logró la infección fúngica bajo una temperatura promedio de 20 °C, la cual pudo haber sido menos conductiva para la enfermedad. A su vez, plantas de C. thymifolia y P. integrifolia fueron inoculadas con el mismo patógeno y se vio que C. thymifolia presenta resistencia a N. oryzae, mientras que P. integrifolia es susceptible. Dada la importancia comercial de C. hybrida y frente al escaso conocimiento de la etiología de las enfermedades que la afectan, este trabajo permitió generar información sobre la interacción patógenos-hospedante y su manejo.

The germplasm of native species is an important source of variability to obtain new products or to solve health and agronomic problems in production systems of existing ornamental varieties. The genetic resources are key strategies for the productive development, and Argentina has biological wealth and history in the germplasm interchange. In that way, the National Institute of Agricultural Technology (INTA) carries out several projects related to the access and the sustainable use of the native genetic resources of the country for research and crop production. Since 2002, the Floriculture Institute INTA conducts the genetic improvement of Calibrachoa genus with the aim of obtaining ornamental varieties for the national and international market. Currently, “Pampa Salmón INTA”, “Overá Fucsia INTA” and “Garden Rose” are the three registered varieties. This genus is one of the most important in the global commercialization of potted ornamental plants and, according to Sakata Seed, the USA import and demand 230 million of annual cuttings of Calibrachoa hybrida, representing u$s 40 million per year. Calibrachoa belongs to Solanaceae Adans family, to the subfamily Cestroideae Schltdl., and the tribe Nicotianae G.Don., it includes 28 species, 12 of them native to Argentina, especially distributed in the Mesopotamia region. It is characterized by having vigorous growth and flowers of different size and colors, like pink, violet, fuchsia, red, yellow, and salmon. The infection by pathogens is one of the most important factors that limits the production of Calibrachoa. Regarding viral diseases, it has been reported in the USA that Calibrachoa is affected by Calibrachoa mottle virus (Carmovirus) and in Israel by Tobacco mild green mosaic virus (Tobamovirus). From 2009, the Floriculture Institute INTA from Argentina carries out viral detections in ornamental cultures by means of the Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). From that year to date, there were no cases of Groundnut ringspot virus nor Tomato chlorotic spot virus in Calibrachoa. In 2012, only two plants were reported to be infected with Calibrachoa mottle virus. During 2010 and 2011, 8 and 3 % of incidence of Cucumber mosaic virus, were estimated, respectively. In addition, there were similar reports of infection by Tomato spotted wilt virus at the same time. On the other hand, the presence of Potyvirus group has been detected with higher incidence rates, during all those years. So, it became necessary to consider the identification of the potyvirus pathogens of Calibrachoa. Thus, we concluded that Potato virus Y (PVY) is the viral species present in those plants, confirmed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and subsequent sequencing. In addition, it was essential to analyze the role of the seeds in PVY transmission and the influence of the environment on disease development in calibrachoa. Therefore, crosses were made between plants infected with PVY, and between plants infected with PVY and plants without PVY, during summer, autumn and spring. In conclusion, and confirmed by RT-PCR, we reported that this viral species is transmitted by seeds independently of the season of the year, and that there is an important incidence of the maternal tissue on the quantity of the produced seeds and the quantity of the plants achieved from the crossings. On the other hand, the identification of resistant genotypes was carried out so as to be able to include variability sources in the genetic improvement programs. Resistant varieties represent a safe and effective strategy to limit the losses caused by diseases and prevent their spread to others crops. For this purpose, mechanical inoculation with a PVY extract was carried out in wild plants of Calibrachoa and Petunia obtained from the germplasm bank of the Floriculture Institute INTA (Calibrachoa caesia, C. thymifolia, C. linoides, Petunia inflata y P. integrifolia). The symptomatology was observed and the virus was detected by ELISA and RT-PCR, showing that all the plants were infected with PVY. This confirmed the absence of resistance to PVY in these plants. Furthermore, the production of healthy plants represents another effective way to reduce the harmful effect of diseases, but this requires the development of methods for pathogen elimination. In vitro regeneration of apical meristems is the most frequently used technique to eliminate viruses, so the optimization of the apical meristem regeneration protocol of Calibrachoa cv. Pampa Salmón INTA was carried out for the comparative analyses of different culture media. The combination of MS (Murashige & Skoog ½) + 0,01 mg L-1 6-bencilaminopurine (BAP) resulted in a high percentage of regeneration of plants in addition to a greater aerial (shoot) and radical (root) production that, consequently, allowed for a high rate of plant survival after transfer to the greenhouse. From this advance, the C. cv. Pampa Salmón INTA plants infected with PVY were cleaned up by 74 %, which was corroborated by RT-PCR. Regarding fungal diseases of C. hybrida, the pathogens Phytophthora nicotianae, P. infestans, P. capsici y P. tropicalis, and Thielaviopsis basicola have been reported globally, while in the national production, the calibrachoa varieties have been found to be susceptible to Fusarium sp., Alternaria tenuissima and Nigrospora oryzae. It had been observed that calibrachoa plants infected with PVY, developed leaf spots caused by N. oryzae, so it was necessary to study that pathogens-host interaction. For this purpose, plants of C. cv. Pampa Salmón INTA infected with PVY and healthy were inoculated with Nigrospora oryzae. As a result, no fungal infection was achieved under an average temperature of 20 °C, which could have been not conductive for the disease. Also, health plants of C. thymifolia and P. integrifolia were inoculated with N. oryzae and, after an incubation period, C. thymifolia presented resistance to N. oryzae, while P. integrifolia did not. Given the commercial importance of calibrachoa and the limited knowledge of the etiology of the diseases that affect it, this work allowed to generate valuable information on pathogen-host interaction and its management.