Producción y evaluación de antígenos recombinantes para el diagnóstico serológico y la generación de vacunas para el control de la anaplasmosis bovina

Abstract

La anaplasmosis bovina, causada por Anaplasma marginale (rickettsia intraeritrocítica transmitida por artrópodos hematófagos), es una enfermedad infecciosa de gran interés por las severas pérdidas económicas que ocasiona. La enfermedad es leve en animales jóvenes (<12 meses) y aguda en animales adultos. Los bovinos que superan la etapa aguda, se transforman en portadores persistentes de A. marginale. En áreas endémicas los rodeos se encuentran en estabilidad enzoótica cuando más del 75% de los bovinos se infecta con A. marginale antes de los 9 meses de edad promedio, lo cual previene la ocurrencia de brotes de anaplasmosis. La vacuna viva basada en A. centrale, especie naturalmente menos patógena que A. marginale, produce inmunidad cruzada parcial y se aplica a cohortes de terneros de hasta 10 meses de edad que no alcanzaron naturalmente la estabilidad enzoótica. La evaluación serológica, realizada a través de la detección de anticuerpos contra la proteína principal de superficie 5 (MSP5) de A. marginale por ELISA de competición (ELISAc), se utiliza para i) identificar portadores de Anaplasma spp., ii) determinar la necesidad de vacunación de los terneros en regiones endémicas y, iii) evaluar la respuesta inmune a la vacunación con A. centrale. El ELISAc basado en MSP5 de A. marginale unida a la chaperona MBP (MBP-MSP5m) y en el anticuerpo monoclonal ANAF16C1, es la técnica recomendada por la OIE para la determinación de anticuerpos contra A. marginale. Esta técnica no se encuentra validada para la detección de anticuerpos contra A. centrale. En este trabajo, se desarrollaron un ELISAc in house (ELISAhc) y un ELISA de doble paratope (ELISAdp) basados en las proteínas truncadas (sin la hélice de transmembrana del extremo N-terminal) MSP5 de A. marginale (tMSP5m) y MSP5 de A. centrale (tMSP5c). La eliminación de la chaperona MBP aumentó la especificidad y la incorporación de tMSP5c incrementó la sensibilidad del ensayo. Adicionalmente, se evitó el uso de anticuerpos monoclonales con el diseño de ELISAdp. Para la prevención de la anaplasmosis se evaluó un inmunógeno recombinante, para uso en animales adultos, compuesto por cinco proteínas subdominantes de A. marginale pertenecientes al sistema de secreción tipo IV (T4SS): VirB9.1, VirB9.2, VirB10, VirB11 y Ef-Tu. Las proteínas fueron clonadas y expresadas en E. coli. Veinte novillos se agruparon en cuatro grupos (G) de cinco animales cada uno (n=5). G1 y G2 se inocularon con una mezcla de 50 μg de cada proteína recombinante con los adyuvantes Quil A® o MontanideTM, respectivamente. G3 y G4 (controles) se inocularon con Quil A o Montanide, respectivamente. Se aplicaron cuatro dosis a intervalos de tres semanas y el día 105, se desafió con una dosis de 107 eritrocitos parasitados con A. marginale. Post desafío, se observaron signos clínicos en todos los animales, con un significativo descenso del hematocrito e incremento del porcentaje de eritrocitos parasitados (p<0,05), los cuales requirieron tratamiento con oxitetraciclina para evitar la muerte. En resumen, en este trabajo se abordó el problema de la anaplasmosis de forma integral, desde el diagnóstico y la prevención; a través del desarrollo de un ELISA de bajo costo y de alta performance para la detección de anticuerpos contra Anaplasma spp., y de la evaluación de una vacuna recombinante para uso en animales adultos, que aunque en las condiciones ensayadas no resultó eficaz, sienta las bases para futuros experimentos.

Bovine anaplasmosis is an infectious disease caused by Anaplasma marginale, an intraerythrocytic rickettsia transmitted by hematophagous arthropods. The disease is of great interest due to the severe economic losses that it causes. The disease is mild in young animals (<12-months old) and acute in adult animals. Bovines that overcome the acute stage become persistent carriers of A. marginale. Rodeos of endemic areas are in enzootic stability when more than 75% of cattle become infected with A. marginale before 9-months old, which prevents the occurrence of anaplasmosis outbreaks. Live vaccine based on A centrale, a naturally less pathogenic species than A. marginale, produces partial cross immunity. It is applied in cohorts of calves up to 10-months old that did not naturally reach enzootic stability. Serological evaluation, performed through detection of antibodies against the major surface protein 5 (MSP5) of A. marginale by a competition ELISA (cELISA), allows us: i) identify carriers of Anaplasma spp., ii) determine the need of vaccination of calves in endemic regions, and iii) evaluate the immune response to the A. centrale vaccine. cELISA based on A. marginale MSP5 bound to the chaperone MBP (MBP-mMSP5) and on the monoclonal antibody ANAF16C1 is recommended by the OIE for the determination of antibodies against A. marginale. This test is not validated for the detection of antibodies against A. centrale. In this work, a cELISA in house (hcELISA) and a double paratope ELISA (dpELISA) were optimized both based on the truncated forms (without N-terminus transmembrane helix) of A. marginale MSP5 (tMSP5m) and A. centrale MSP5 (tMSP5c). Expression of MSP5 without MBP increased the specificity and the incorporation of tMSP5c increased the sensitivity of the assay. Additionally, the use of monoclonal antibodies was avoided in the dpELISA. For the prevention of anaplasmosis, a recombinant immunogen was developed for its evaluation in adult cattle. This immunogen was formulated with the subdominant proteins of type IV secretion system (T4SS) of A. marginale, VirB9.1, VirB9.2, VirB10, VirB11 and Ef-Tu, cloned and expressed in E coli. Twenty steers (n=20) were randomly clustered into four groups (G) of five animals each. Cattle from G1 and G2 were inoculated with a mixture of 50 μg of each recombinant protein with Quil A® and MontanideTM adjuvants, respectively. Cattle from G3 and G4 (controls) were inoculated with Quil A and Montanide adjuvants, respectively. Cattle received four doses at three-week intervals and were challenged with 107 A. marginale parasitized erythrocytes at day 105. After challenge, all cattle showed clinical signs, with a significant decreased of packed cell volume and a significant increased of parasitized erythrocytes (p<0.05), requiring treatment with oxytetracycline to prevent death. In summary, in this work, bovine anaplasmosis was studied integrally with diagnosis and prevention approaches. A low-cost and high-performance ELISA was developed for the detection of antibodies against Anaplasma spp. and a recombinant vaccine was evaluated for use in adult cattle. The vaccine, which under the tested conditions was not effective, establishes guidelines for future assays.