Cartografiado de QTL y genes candidatos asociados a metabolitos determinantes de la calidad de fruto en melocotón

Abstract

Tradicionalmente los programas de mejora del melocotón (Prunus persica (L.) Batsch) se centraron fundamentalmente en la obtención de genotipos elite de alta productividad, resistentes a plagas y patógenos, adaptados a diferentes zonas agroecológicas y que produzcan frutos de gran tamaño y buen aspecto. Como resultado, muchos de estos programas han obtenido cultivares de excelentes características agronómicas. No obstante, el mejoramiento selectivo hacia caracteres agronómicos puede ir en detrimento de la calidad organoléptica del fruto como fue demostrado en el caso de fresa y tomate donde algunos aromas se perdieron en el proceso de mejora (Klee and Giovannoni, 2011; Olbricht et al., 2008). En melocotón, la disminución de la calidad del fruto ha sido percibida por los consumidores y además es la mayor causa de insatisfacción de los mismos (Bruhn et al., 1991). Un probable consecuencia de esto puede ser el bajo consumo de melocotón en comparación con otras frutas como el plátano y la manzana (Crisosto, 2006). Estudios pioneros han establecido que el aroma es uno de los atributos principales por los cuales los consumidores juzgan la calidad del melocotón (Bruhn, 1995). El aroma está definido íntegramente por los compuestos volátiles orgánicos (VOCs) los cuales también contribuyen al sabor del fruto en combinación con azucares y ácidos orgánicos. Los volátiles del melocotón han sido estudiados con anterioridad, describiéndose un poco más de 100 compuestos incluyendo: lactonas, esteres, terpenos, aldehídos, ácidos carboxílicos y alcoholes entre otros [(Aubert and Milhet, 2007) y referencias incluidas]. La identificación de regiones génicas y genes candidatos para el control de los aromas del fruto resulta un punto fundamental para su posterior implementación en programas de mejora con el fin de obtener melocotones de mayor calidad. En este sentido nos propusimos la identificación de QTLs (del inglés ``Quantitative trait loci'') y genes candidatos involucrados en la producción de los compuestos volátiles del melocotón. El desarrollo reciente de un conjunto técnicas analíticas de mayor potencia permitió el advenimiento de una nueva plataforma tecnológica, la metabolómica, que contempla el análisis global de los metabolitos de un organismo permitiendo abordar la evaluación de calidad de una forma más exhaustiva. Dentro de ellas, la tecnología HS-SPME-GC-MS (del inglés ``Head Space-Solid Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectroscopy'') es actualmente el método de elección para el análisis de volátiles debido a su alta sensibilidad, reproducibilidad y robustez (Tikunov et al., 2005). Además el análisis en conjunto de los datos derivados de la metabolómica con otras tecnologías de alto rendimiento para el análisis de expresión de genes, como lo son los microarrays, ha permitido el descubrimiento de genes implicados la producción de diversos metabolitos en Arabidopsis y tomate (Mounet et al., 2009; Saito and Matsuda, 2010; Carrera et al. 2012). En una primera instancia nos propusimos el desarrollo de una plataforma de alto rendimiento basada en HS-SPME-GC-MS para la identificación y cuantificación de compuestos volátiles en fruto de melocotón. Se ensayarán diferentes protocolos para la extracción de los compuestos volátiles con el fin de identificar el más adecuado (es decir el más sensible manteniendo la reproducibilidad y con una robustez satisfactoria). Una vez desarrollado un protocolo adecuado se analizará en paralelo la evolución de los compuestos volátiles y la expresión de genes mediante microarrays durante la maduración de diferentes genotipos de melocotón con el objetivo de identificar patrones comunes de co-regulación entre metabolitos y genes durante el desarrollo del fruto. Por último, se propuso la identificación de regiones génicas implicadas en la producción de volátiles mediante análisis de QTLs. = The improvement of fruit quality is probably the main challenge facing the peach industry nowadays. The volatile organic compounds (VOCs) are a heterogeneous group of substances that are intimately related to peach quality since they entirely define its aroma and in combination with others compounds like sugars and organic acids shape fruit flavor. Among peach VOCs, the lactone‐type compounds are those conferring the characteristic peach notes for both aroma and flavor, while others compounds such as esters and terpenoids contributes in a lesser extent by adding specific notes often described as “fruity” and “floral”. Another group of compounds consisting of aldehydes and alcohols, known generically as lipid‐derived volatiles, should have a less desirable impact on the flavor of the fruit since they seem to provide notes associated with immature fruit. Describing in detail the components of this complex group of compounds as well as establishing the genetic and molecular bases that control their synthesis is a prerequisite before undertaking any peach breeding project aimed to increase peach quality with more chances of success. In the current thesis, the study of the volatile compounds production was addressed holistically by means of a series of ʺomicsʺ complementary technologies: metabolomics, transcriptomics and genomics. Initially a high‐throughput metabolomics platform for identification and quantification of the VOCs from the fruit was established. Besides the screening of a large proportion of the VOCs from the fruit, this platform enabled, the definition of groups of compounds that share a common regulation. By a combination of a series of analyzes based on data correlation it was found that the synthesis of volatiles with positive impact in aroma (such as lactones and certain esters) occurs in a coordinated manner. The same happens with negative impact compounds (lipid derived compounds) and other compounds with less impact (e.g. terpenoids and phenolics). All this suggesting that the peach volatilome is organized into a series of interconnected modules. The discovery of this regulatory network underlying volatile synthesis was then exploited to propose a number of candidate genes by a functional genomics approach. The gene expression levels were analyzed by miroarrays and the volatile contents were profiled in parallel along maturation time course series in the two parental genotypes of our breeding population. The combined analysis of the co‐regulation patterns allowed the identification of different genes whose expression was highly correlated with the levels of lactones, esters, terpenoids, phenolic compounds and lipid derivatives among others, which were proposed as possible candidate genes involved in the synthesis of these aromas. One of the candidate genes, identified as being associated with the accumulation of lactones and esters, was cloned and by functional analysis showed to be an oleate ω‐6 desaturase involved in the generation of linoleic acid, a potential precursor peach aromas. Complementarily, the genetic control of the production of volatile was described by a broad scale QTL analysis. An F1 peach population segregating for fruit aroma was analyzed combining the metabolomics platform developed previously and a high‐throughput genotyping platform based on SNPs markers detection. The high organization of the volatiloma in co‐regulated modules was reflected in the identification of loci controlling several members belonging to different groups of co‐regulation. In this way, three loci that control the synthesis of lactones and some esters were identified in linkage groups 4, 5 and 6 (LG4, LG5 and LG6). Similarly, it was found that the synthesis of monoterpenes is controlled by a single locus located in the upper end of LG4. The results obtained indicate the presence of important regions in peach genome affecting fruit volatile production and suggest that it should be possible to improve the flavor of the fruits by molecular marker‐assisted breeding. The integration of the results along with the interpretation in light of the existing knowledge allowed the description of the peach volatilome, its regulatory network and the identification of genomic regions controlling their synthesis as well as propose candidate genes involved in the synthesis of the major peach aromas, which could be also used as targets for classical and biotech breeding for flavor and aroma in peach.