Evaluación cinético-dinámica in vivo e in vitro en Haemochus contortus resistente a lactonas macrocíclicas

Abstract

La parasitosis gastrointestinal continúa siendo una de las principales causas de pérdidas económicas en la producción pecuaria y dentro de ella, la haemonchosis es sin duda la enfermedad más patógena y la que mayores pérdidas genera en la producción ovina. El control de las parasitosis debiera consistir en diversas estrategias de manejo de los animales y las pasturas junto con la administración de antihelmínticos, luego del diagnóstico parasitológico y terapéutico adecuado. Sin embargo, en las últimas tres décadas el control se basó casi exclusivamente en el utilización masiva de drogas antihelmínticas de amplio espectro cada vez más eficaces y persistentes. El incremento de la resistencia antihelmíntica junto con las nuevas tendencias de producción orgánica y disminución de los residuos de drogas en los alimentos generó interés en el estudio de nuevas estrategias de control. En este contexto el presente trabajo de Tesis Doctoral abordó la resistencia antihelmíntica desde un enfoque integrador fármaco-parasitológico, cuyo objetivo fue estudiar la relación que existe entre las concentraciones de diferentes lactonas macrocíclicas en plasma, tejidos/fluidos de localización parasitaria del ovino y en el parásito “blanco” y la eficacia sobre Haemonchus contortus resistente. Para ello se dividió la Tesis en 3 secciones experimentales. En la Primera se realizó la caracterización in vivo de factores que afectan la relación entre concentraciones en el sitio de localización parasitaria, concentraciones en el parásito “blanco” (H. contortus) y eficacia antihelmíntica para diferentes lactonas macrocíclicas en corderos infestados con parásitos resistentes y bajo condiciones estandarizadas. Dentro de esta sección se relizaron 3 experimentos en donde se comparó la utilización de dos vías de administración (subcubtánea e intraruminal), las diferentes lactonas macrocíclicas (ivermectina-abamectina-moxidectina) y la duplicación de la dosis como estrategias para aumentar la eficacia antihelmíntica. Se encontró que si bien la disposición plasmática es mayor al utilizar la vía subcutánea, las concentraciones son mayores en los tejidos y contenidos del tracto gastrointestinal a los 2-3 días post-tratamiento por vía intraruminal y esto produce un efecto relevante cuando se trata de nematodos resitentes, de tal forma que la eficacia contra H. contortus fue un 40 % mayor al utilizar la vía intraruminal, coincidentemente con las mayores concentraciones de ivermectina halladas dentro del parásito. Esto demuestra que la incorporación de la droga al parásito por vía transcuticular es relevante para la eficacia clínica, aún para aquellos parásitos que son hematófagos. En el segundo experimento se encontró que a la dosis terapéutica, moxidectina fue más efectiva frente a nematodos resistentes a ivermectina. Las concentraciones de los 3 fármacos encontradas en los tejidos del tracto gastrointestinal durante los primeros 2 días post tratamiento es relevante para su acción sobre los nematodos resistentes. Sin embargo, a pesar de que moxidectina obtuvo las menores concentraciones acumuladas en los parásitos adultos, el total de parásitos recuperados (al día 2) post tratamiento y su eficacia antihelmíntica fue mayor que la de ivermectina y abamectina. En el tercer experimento, donde se comparó la eficacia y la acumulación de fármacos en los tejidos de los corderos y en el H. contortus, utilizando ivermectina y moxidectina a la dosis terapéutica y al doble de la dosis terapéutica, debido al extremo grado de resistencia, sólo la administración de doble dosis de moxidectina fue efectiva. En la Sección Experimental II, se caracterizó in vitro la actividad de las lactonas macrocíclicas contra H. contortus resistente, mediante el desarrollo del test de inhibición de motilidad larval utilizando estadios larvarios de H. contortus. Esta prueba resultó ser una prueba eficaz para establecer diferencias entre aislamientos susceptibles de resistentes. Sin embargo, es una prueba difícil de implementar para el diagnóstico de resistencia de rutina. También se desarrolló un método ex vivo, para caracterizar el ingreso del fármaco dentro de los parasitos adultos. El incremento de la exposición a ivermectina y moxidectina se reflejan como un incremento en la cantidad de droga recuperada en los H. contortus. En la Sección Experimental III se estudiaron los cambios génicos en H. contortus asociados al fenómeno de resistencia. Se validó una metodología para cuantificar la expresión de glicoproteína-P2 en aislamientos de H. contortus susceptibles y resistentes a LMs. Se encontró una sobreexpresión en los aislamientos de parásitos resistentes. Además, el tratamiento con ivermectina, a diferencia de abamectina y moxidectina, fue el único que indujo un incremento significativo de la expresión de glicoproteína-P2 en los especímenes de H. contortus resistentes recuperados de corderos tratados a los 0,5 y 1 días post-tratamiento comparado con los H. contortus recuperados de animales sin tratamiento. Como conclusión, el presente trabajo de Tesis Doctoral a través de estudios in vivo, in vitro y utilizando herramientas de la biología molecular aporta información que es de utilidad para diseñar estrategias para prologar la vida útil de las lactonas macrocíclicas siempre que sean usados de manera racional y con una base de evaluación profesional por el veterinario.

Gastrointestinal parasitic diseases are the main causes of economic losses in livestock. Haemonchus contortus infection is undoubtedly the most pathogenic disease that causes the greatest losses in sheep production. The parasite control should be based on management strategies of animals and pastures together with the rational administration of anthelmintics after the appropriate parasitological diagnostic. However, in the last three decades, parasitic control has been based almost exclusively on the massive use of broad-spectrum and persistent anthelminthic drugs. The increase in anthelminthic resistance along with the new tendency of organic production and reduction of drug residues in food generated interest in the study of new control strategies. In this context, the present work of Doctoral Thesis focused on the anthelmintic resistance from an integrative pharmaco-parasitological approach. The objective of the currern work was to study the relationship that exists between the concentrations of different macrocyclic lactones in plasma, tissues / fluids of parasitic location of sheep and in the target parasite and the efficacy against resistant H. contortus. The Thesis was divided into 3 experimental sections. In the first, the in vivo characterization of factors affecting the relationship between concentrations at the site of parasitic localization, concentrations in the target parasite and anthelmintic efficacy for different macrocyclic lactones in lambs infested with resistant nematodes was evaluated under standardized conditions. Three experiments were carried out within this section, comparing the use of two administration routes (subcutaneous and intra-ruminal), the different macrocyclic lactones (ivermectin-abamectin-moxidectin) and the duplication of the dose as strategies to increase the anthelmintic efficacy. The results showed that although the plasma disposition is greater after the ivermectin administration by the subcutaneous route, higher drug concentrations were measured in the tissues and contents of the gastrointestinal tract after 2-3 days post-treatment by intraruminal route. The drug increment in the target tissues was reflected in a higher concentrations of ivermectin found within the parasite and a higher efficacy against H. contortus after the intraruminal administration. The current results corroborated that the drug entry to the parasite by the transcuticular route is relevant for clinical efficacy, even for those parasites that are hematophagous. In the second experiment, it was found that moxidectin administered at the therapeutic dose was more effective vi against nematodes resistant to ivermectin. Although moxidectin showed the lowest accumulated concentrations in adult parasites, lower number of parasites were recovered (at day 2) after moxidectin treatment and its anthelmintic efficacy was greater compared to those obtained after ivermectin and abamectin administration. In the third experiment, the influence of the dose rate on the efficacy and accumulation of drugs in the target tissues of lambs and in H. contortus was evaluated. Due to the high level of resistance, only the administration of double dose of moxidectin was effective. In Experimental Section II, the activity of macrocyclic lactones against resistant H. contortus was characterized in vitro by the development of the larval motility inhibition test using larval stages of H. contortus. This test demonstrated to be an effective test to establish differences between resistant and susceptible isolates. However, it is a difficult test to implement for the routinely diagnostic of anthelmintic resistance. An ex vivo method was also developed to characterize the entry of the drug into the adult parasites. The increased exposure to ivermectin and moxidectin enhanced the amount of drug recovered in H. contortus. In Experimental Section III, the genetic changes in H. contortus associated with the phenomenon of resistance were studied. The expression of glycoprotein-P2 in susceptible and resistant H. contortus isolates was determined. Overexpression was found in isolates of resistant parasites. In addition, treatment with ivermectin, unlike abamectin and moxidectin, was the only one that induced a significant increase in the expression of glycoprotein-P2 in resistant H. contortus recovered from treated lambs at 0.5 and 1 day post-administration. In conclusion, the present Doctoral Thesis validated in vivo and in vitro studies and molecular tools to improve the parasitic control strategies and to extend the lifespan of macrocyclic lactones. To obtain this in the field, it is necessary the rational use of these drugs in each farm with a previous professional evaluation by the veterinarians.